HPLC测定归脾丸(浓缩丸)中黄芪甲苷的含量

王 景

（解放军第153医院，河南郑州 450007）

HPLC测定归脾丸(浓缩丸)中黄芪甲苷的含量

王 景

（解放军第153医院，河南郑州 450007）

目的：建立归脾丸(浓缩丸)中黄芪甲苷含量的HPLC测定方法。方法：采用反相高效液相色谱法，使用Agilent HC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，以乙腈-水（34∶66）作为流动相。流速 1.0 ml/min，检测波长 205 nm。结果：黄芪甲苷在12.5～100.0 μg/ml范围内线性较好（r=0.999 7），平均回收率为98.34%（RSD为0.41%）。结论：该方法快速、简便、可靠、准确度高、重复性好，处方中其他成分对测定亦无干扰，分离效果好，可用于归脾丸中黄芪甲苷含量测定。

归脾丸；黄芪甲苷；高效液相色谱法；含量测定

归脾丸(浓缩丸)收载于《卫生部药品标准中药成方制剂(第七册)》，标准编号：WS3-B-1303-93，由党参、黄芪(蜜炙)、白术（炒）、甘草(蜜炙)、远志(制)、酸枣仁、当归、木香等 11 味药组成，具有益气健脾、养血安神之功效。用于心脾两虚、气短心悸、失眠多梦、头昏头晕、肢倦乏力、食欲不振、崩漏便血。归脾丸中黄芪来源于豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，性温、味甘，为常用中药，具有补气固表、利尿排毒、排脓、敛疮生肌等功效[1]。黄芪总皂苷是黄芪的主要有效部位，黄芪甲苷作为总皂苷的主要活性指标成分之一，常用作黄芪药材及含黄芪复方制剂的质量评价指标[2]。归脾丸制剂标准尚无含量测定项，为了提高药品质量，本文建立了高效液相色谱法（HPLC）测定归脾丸中黄芪甲苷含量的方法，现报道如下：

1 仪器与试剂

1.1 仪器

日本岛津LC-2010C高效液相色谱仪。

1.2 试剂

黄芪甲苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110781-200613），归脾丸（河南省宛西制药股份有限公司，批号：090105，090405，090707）。乙腈为色谱醇（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20080102），水为纯化水，其他化学试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为 Agilent HC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水（34∶66），流速为 1.0 ml/min，检测波长为 205 nm，进样体积为20 μl，柱温为室温，理论板数不低于4000。

2.2 实验溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称定黄芪甲苷对照品10 mg，置100 ml量瓶中，加甲醇适量，振摇使溶解，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5 ml，置10 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为50 μg/ml的黄芪甲苷。其作为对照品溶液，备用。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品细粉约5 g，置索氏提取器中，加甲醇40 ml，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流4 h，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10 ml，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40 ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40 ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5 ml使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱（内经为1.5 cm，柱高为12 cm），以水50 ml洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30 ml洗脱，弃去洗脱液，继用70%乙醇80 ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，备用[3]。

2.2.3 阴性供试品溶液的制备 取不含黄芪的空白制剂样品，照2.2.2项下供试品溶液制备方法制备，备用。

2.3 系统适用性实验

分别吸取2.2项下对照品溶液，供试品溶液，阴性供试品溶液各20 μl注入色谱仪记录色谱图，黄芪甲苷对照品峰位置无假阳性峰干扰，黄芪甲苷峰与其他峰分离完全，阴性供试品溶液在黄芪甲苷出峰位置无干扰。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系 取上述对照品溶液分别进样5、10、20、15、40 μl，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为横坐标，进样浓度（μg/ml）为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为：Y＝15903X+4660.7（r=0.9997）。 这表明黄芪甲苷在 12.5～100.0μg/ml浓度范围内线性关系良好。

2.4.2 精密度实验 精密吸取2.2.1项下对照品溶液20 μl，分别重复进样5次，结果黄芪甲苷峰面积的平均值为316840，其RSD为0.78%。结果表明，仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取样品（批号：090105），按供试品制备方法制备。于 0、4、8、12、16 h 进样分析，记录峰面积，其 RSD 为0.81%，其结果表明供试品溶液在16 h内稳定。

2.4.4 重复性试验 取同一批号(090105)的样品5份，按供试品制备方法制备，测定含量，结果表明方法重复性较好。具体见表1。

表1 重复性实验

2.4.5 回收率试验 取本品（批号：090105）适量，共9份，约为2.5 g的80%、100%、120%，精密称定，加入一定量的黄芪甲苷对照品，按2.2.2项下方法制备，注入高效液相色谱仪，测定，计算回收率。测得黄芪甲苷平均加样回收率(n=9)为99.71%，RSD=0.35%。结果表明，用高效液相法测定黄芪甲苷含量准确度高。具体测定结果见表2。

表2 回收率实验（n=9）

2.4.6 含量测定 供试品溶液以2.2.2项下方法制备，用0.45 μm滤膜过滤，取续滤液，在2.1项下色谱条件下进样，由峰面积值根据线性回归方程计算含量(表3)。

表3 样品含量测定结果

3 讨论

3.1 样品提纯方法的考察

本实验参考《中国药典》2010版一部和有关文献，确定以正丁醇萃取。氨试液洗涤正丁醇萃取液以除去提取液中色素、酸性成分的干扰，然后经D101型大孔吸附树脂柱，用70%乙醇洗脱，洗脱液蒸干，再用甲醇溶解。实验结果显示方法学考察均符合要求。

3.2 检测波长的确定

取2.2.1项下的溶液，在200～400 nm波长范围扫描，结果在205 nm处有较大吸收，故选用205 nm波长处作为检测波长。

3.3 检测方法的选择

已报道的黄芪甲苷的含量测定方法有：紫外分光光度法、薄层扫描法、高效液相色谱法和荧光法[4]采用薄层扫描法、比色法检测周期长，重现性差。近年来，文献报道黄芪中黄芪甲苷含量采用HPLC-ELSD法测定，该法具有高效、灵敏、快速等优点，但该法计算繁琐，影响因素多。本文采用HPLC法测定归脾丸中黄芪甲苷的含量，操作简便、准确、灵敏度高，阴性无干扰，可作为该制剂的质量控制方法。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].一部.北京:化学工业出版社,2005:212-213.

[2]张金红,周晶,吴志丽,等.HPLC-ELSD法测定黄芪及金芪降糖片中黄芪甲苷的含量[J].天津医科大学学报,2010,16(1):26-29.

[3]国家药典委员会.中国药典[M].一部.北京:中国医药科技出版社,2010:284.

[4]蒋红艳,杨元娟,何静,等.黄芪及其制剂中黄芪甲苷定量分析方法研究进展[J].中国医药指南,2009,7(10）:209-211.

Determination of Astragaloside IV in Guipi pill(Concentrated Pills)by HPLC

WANG Jing
(153 Hospital of PLA,Henan Province,Zhengzhou 450007,China)

Objective:To establish a method for content determination of Astragaloside IV in Guipi pill(concentrated Pills)by HPLC.Methods:The experimental condition of the RP-HPLC method was as follows:Agilent HC-C18column(5μm，250×4.6mm)，with linear gradient elution using methanol and water （34∶66）;The flow rate was 1.0 ml/min;Detected wave length was 205 nm.Results:Astragaloside IV demonstrated good linear relationship in the range of 12.5～100 μg/ml （r=0.999 7）.The average recovery rate was 98.34%withRSDof 0.41%.Conclusion:The method is simple,reliable,accurate and It could be used in the determination of Astragaloside IV in Guipi pill.

Guipi pill;Astragaloside IV;HPLC;Determination

R943.1

B

1674-4721（2010）09（b）-046-02

2010-07-16)