盘基网柄菌allC的克隆、表达和多克隆抗体的制备

陈能星, 魏晓静, 刘 伟, 侯连生

(华东师范大学生命科学学院,上海 200062)

盘基网柄菌allC的克隆、表达和多克隆抗体的制备

陈能星, 魏晓静, 刘 伟, 侯连生

(华东师范大学生命科学学院,上海 200062)

运用RT-PCR技术从盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)总m RNA中克隆到了尿囊酸酶基因(allC),该基因编码区开放读框长1 100 bp,编码的蛋白约42 kD.由于是在野生型和突变型细胞中差异表达的片段,表明该基因在盘基网柄菌多细胞发育中起到重要作用,因此将allC克隆入融合表达载体p ET-32a(+),在大肠杆菌 E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达带有6个组氨酸标签的尿囊酸酶(ALC)融合蛋白,经镍柱亲和层析,获得了电泳纯蛋白.用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体.EL ISA测得制备的抗ALC蛋白的多克隆抗体的效价可达1∶64 000,Western Blo tting检测证明该抗体有较强的针对ALC蛋白的专一性.这些数据表明重组质粒表达的ALC融合蛋白具有良好的抗原性,制备ALC的多克隆抗体有良好特异性和效价,能够满足针对ALC免疫印迹和细胞内定位检测等实验要求,为深入研究ALC蛋白在盘基网柄菌多细胞发育的功能作用提供了有力工具.

盘基网柄菌; 尿囊酸酶; 原核表达; 蛋白纯化; 多克隆抗体

Abstract:The coding region of allC isobtained from totalm RNA of Dictyostelium discoideum by RT-PCR.The results show that the length of allC is 1 100 bp w ith sequence analysis and coded p rotein is 42 kD.Becase it is a differentially exp ression fragments,indicating that the gene p lay an impo rtant role in multicellular development and allC was cloned into the fusion exp ression vector p ET-32a(+)with 6 His tagged and exp ressed in E.coli BL21(DE3)host cells.and then purified by Ni2+affinity chromatography column and fusion p rotein purified was used to immune the New Zealand rabbits fo r p reparing polyclonal antibody.The fusion p rotein was successfully exp ressed and polyclonal antibody was also successfully obtained.The potency of the antibody was as high as 1∶64 000.The specificity of antibody was p roved by Western Blo tting a-nalysis of exp ression p roduct of allC.These data suggest ALC fusion p rotein has the good antigenicity.The antibody w ith high titer and specificity was obtained in the satisfaction of Western blot and localization experiment request,w hich was the foundation to farther study the characters of the allantoicase p rotein and their function during Dictyostelium discoideum development.

Key words:D ictyostelium discoideum; allantoicase; p rokaryotic exp ression; p rotein purification; polyclonal antibody

0 引 言

盘基网柄菌(D ictyostelium discoideum)是一种低等的真核原生生物,在营养丰富的条件下以阿米巴单细胞形式吞噬细菌为食,行二分裂方式繁殖生长.一旦食物匮乏,单个细胞聚集成多细胞体,细胞历经细胞丘、蛞蝓体和拔顶阶段完成发育和分化过程,最终形成由孢子细胞和柄细胞组成的子实体.盘基网柄菌与后生动物有许多共同的细胞生理生化反应,如吞噬作用、趋化性和信号转导等.由于其具有单细胞和多细胞的生命过程,生命现象丰富,作为非常好的模式动物,用来研究细胞的运动性,细胞间的信号转导以及细胞类型的特化和细胞发育等.

尿囊酸酶(allantoicase)是嘌呤代谢中一种重要的酶.尽管在不同物种内,尿囊酸酶基因都位于染色体上[1-4],但其表达的产物却定位在细胞内不同位置上.鱼类的尿囊酸酶蛋白位于过氧物酶体和线粒体[5],而头索类的文昌鱼尿囊酸酶蛋白则定位于细胞质中,蛙类则定位在线粒体[6].有些学者认为,在哺乳动物中尿囊酸酶没有活性[7],但是在鼠、牛和人等哺乳动物组织内,却发现尿囊酸酶基因是转录表达的[3,8].因此,对尿囊酸酶结构与功能的了解还不够全面.社会变形虫盘基网柄菌(D ictyostelium discoideum)在营养丰富的条件下以二分裂方式繁殖生长,一旦食物耗尽,就进入多细胞发育阶段.gp150突变细胞株(A K127细胞株)不能完成整个发育过程,停留在细胞疏松结合阶段[9].本实验室运用DDRT-PCR方法从发育14 h野生型细胞 KA x-3和突变细胞A K127中获得一差异表达片段,2005年3月2日递交 GeneBank后,获得登陆号A Y894718[10].之后盘基网柄菌全基因组测序工作完成,我们通过同源序列比对,发现该片段的98%的碱基与盘基网柄菌中尿囊酸酶基因(allC)部分片断完全一致,E值为0.该基因位于第三号染色体上,长度为1 100 bp,编码的蛋白分子量约42 kD[11].这说明在低等原生动物中也存在尿囊酸酶,另一方面,由于尿囊酸酶基因是我们筛选出的差异表达片段,提示了该基因在盘基网柄菌多细胞发育中可能发挥了某种作用.这引起我们对尿囊酸酶功能研究的极大兴趣.本研究克隆了尿囊酸酶基因,并对该基因进行了表达,制备了多克隆抗体,为研究该蛋白在盘基网柄菌发育调控中的功能定位奠定了基础.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 质粒和菌株

克隆载体pMD18-T Simp le Vector购自 TA KARA公司,大肠杆菌表达载体p ET-32a,大肠杆菌DH5α和大肠杆菌BL 21(DE3)由华东师范大学吴自荣教授实验室馈赠.

1.1.2 实验动物

新西兰大白兔3只,雄性,体重2.0～2.5 kg,购自中国科学院上海实验动物中心.

1.1.3 酶和试剂

TaqDNA聚合酶,dN TP,T4DNA连接酶,限制性内切酶Bam HⅠ和 H indⅢ,蛋白质分子量标准均购自TA KARA公司,DNA凝胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司,逆转录试剂盒购自 TOYOBO公司,Ni-NTA琼脂糖柱购自Q IAGEN公司,弗氏佐剂为Sigma公司产品,AP标记羊抗兔二抗为Bio-Rad公司产品,PCR引物合成由上海生工完成.

1.2 方法

1.2.1 a llC基因克隆

以提取发育14h盘基网柄菌细胞的总RNA为模板,按照RT-PCR试剂盒说明逆转录合成cDNA第一链.根据全长尿囊酸酶基因设计上下游引物,上游引物 P1:5’-CG GGA TCC A TGGTTTA TGCAAA TAA TAA TA TTG,斜体字表示Bam HⅠ酶切位点;下游引物P2:GCC AAGCTT TTA TTGTTGTCTA TCTGA GGTT,斜体字表示 H indⅢ酶切位点,PCR扩增目的基因.

1.2.2 原核表达载体的构建

DNA回收试剂盒回收目的片段与克隆载体pMD18-T Simp le Vecto r连接,转化大肠杆菌DH5α,蓝白斑筛选阳性克隆进行菌落PCR,小量碱法抽提质粒DNA,Bam HⅠ和 H indⅢ双酶切鉴定;将重组质粒pMD18-T-ALC经Bam HⅠ和 H indⅢ双酶切后回收纯化 allC目的片段,再与相同酶切的p ET-32a(+)载体连接,构建重组表达质粒p ET-32a(+)-ALC,阳性质粒进行菌落PCR及Bam HⅠ和 H indⅢ双酶切及测序鉴定.同时为了增加目的蛋白的可融性,将目的片段与p ET-32a(+)载体上的硫氧还蛋白(Trx)基因融合表达.

1.2.3 融合尿囊酸酶的诱导表达

挑取新转化的单菌落到3 m L LB(Amp+)培养液中37℃培养过夜,次日以5%的接种量接入20 m L LB(Amp+)培养液中,在OD值达到0.6,设未诱导的菌液为阴性对照后,加入IPTG至终浓度1 mmol/L;继续诱导表达4 h后,取两管上述培养液各1 m L,12 000 r/min离心1 min,弃上清,一管菌体用PBS缓冲液重悬,另一管菌体沉淀超声破碎后用 PBS缓冲液重悬.之后都加入等体积的2×SDS上样缓冲液,100℃加热煮沸变性3～5 min,SDS-PAGE(12%分离胶,5%浓缩胶)电泳分析表达产物.

1.2.4 融合尿囊酸酶的纯化

收集诱导表达后的菌液,4℃12 000 r/m in离心5 m in,冰浴中超声破菌,12 000 r/min离心15 min,沉淀用2 mol/L尿素缓冲液反复洗涤多次,然后用8 mol/L尿素溶解,37℃温育10 min后离心收集上清,按照Q IAGEN公司Ni-N TA Superflow Cartridge使用手册过柱纯化尿囊酸酶蛋白.

1.2.5 抗血清的制备

纯化后的尿囊酸酶蛋白SDS-PAGE电泳,胶用预冷的0.25 mol/L KCL溶液染色,切下目的条带后液氮研磨,溶于PBS至终浓度为1 m g/m L,常规法免疫新西兰大白兔.首次免疫时,按每只1 mg的剂量,加等体积的弗氏完全佐剂,充分混匀后皮下多点注射;1周后加强免疫,抗原量为初次免疫的1/2,加弗氏不完全佐剂,加强免疫3次,第4次免疫后2周耳缘静脉取血测效价,符合要求后颈动脉取血,分离血清,-20℃分装保存.

1.2.6 兔抗allC抗体的效价测定

间接EL ISA法检测抗血清效价,将纯化的目的蛋白用包被液稀释至浓度为1μg/100μL后加入酶标板,100μL/孔,4℃过夜.封闭液室温封闭1 h后,每孔加100μL倍比稀释的抗血清,同时设立阴性对照和空白对照.37℃放置1 h,用 PBST洗涤液洗3次,加入1∶3 000的 HRP标记的山羊抗兔IgG,37℃放置1 h,再用PBST洗3次,OPD显色,最后用酶标仪测定OD490.以阳性血清的平均OD490值(P)和阴性血清的平均OD490值(N)之比即 P/N≥

2.1 判定为阳性.

1.2.7 多克隆抗体的Western Blotting分析

以纯化的 ALC蛋白作为抗原,常规方法进行 Western Blotting分析,其中一抗为1∶1 000稀释的ALC多抗血清,二抗为1∶4 000稀释的AP标记的羊抗兔 IgG,以免疫前的兔血清做对照,用NBT/BCIP显色观察结果;同时以未诱导、诱导和纯化前后的菌体蛋白为抗原,进行免疫印迹分析.

2 结 果

2.1 allC基因的克隆

以总RNA为模板,利用上游引物 P1和下游引物P2进行RT-PCR,得到约1 100 bp的扩增产物(见图1);扩增的基因片段经测序鉴定DNA编码区长1 100 bp,阅读框完整,与盘基网柄菌的allC基因完全一致,说明成功克隆出allC基因.

图1 allC基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析(单位:bp)Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR p roductsof allC(Unit:bp)

2.2 p ET-32a(+)-ALC重组质粒的构建与鉴定

以总RNA为模板,用预先设计的引物进行PCR扩增,获得约1 100 bp的allC基因.产物与中间克隆载体pMD18-T Simp le Vector连接后双酶切验证,在琼脂糖凝胶电泳图中可见一条1 100 bp的目的片段和2 500 bp的载体片段(见图2);再将目的片段与表达载体p ET-32a(+)连接,得到表达质粒p ET-32a(+)-ALC,经酶切验证,在电泳图中可见一条1 100 bp的片段和7 500 bp的载体片段(见图3).结果都与预期一致,经核酸序列分析证明重组质粒构建成功.

2.3 重组融合蛋白的诱导表达

将诱导表达后的菌体进行超声破碎,离心后分别收集沉淀和上清,12%的SDS-PAGE电泳分析,与空载体相比,在62 kD处可见一条明显增粗的新生蛋白条带(见图4泳道2),与预期的分子量相符(尿囊酸酶蛋白分子量为42 kD,为了增加表达产物的可溶性,又连上了硫氧还蛋白基因,其表达产物的分子量约20 kD),说明ALC融合蛋白的表达获得成功;而上清中62 kD处没有出现目的条带(见图4泳道3),目的蛋白主要存在于沉淀中(见图4泳道4),说明融合表达的ALC蛋白主要以包涵体形式存在.

图2 pMD18-T-allC的酶切鉴定(单位:bp)Fig.2 Identification of PMD18-T-allC by enzymatic digestion(Unit:bp)

图3 重组质粒p ET-32a-allC的酶切鉴定(单位:bp)Fig.3 Identification of recombinant p lasmid p ET-32a(+)-allC by enzymatic digestion(Unit:bp)

图4 重组融合蛋白p ET-32a(+)-ALC的诱导表达(单位:kD)Fig.4 The exp ression of pp ET-32a(+)-ALC(Unit:kD)

2.4 融合蛋白的纯化分析

重组菌液超声破碎后反复洗涤,用8 mol/L尿素溶解后过Ni-N TA柱纯化,SDS-PAGE分析.纯化后的ALC蛋白为单一的蛋白条带(见图5),且与诱导表达的蛋白大小一致,通过凝胶成像系统图象分析,纯化后的尿囊酸酶蛋白纯度达到95%以上;空载体和未诱导的融合蛋白62 kD处无条带,表达后的菌体蛋白和纯化前蛋白均有杂带.

图5 重组融合蛋白的纯化(单位:kD)Fig.5 Purification of the recombinant p rotein(Unit:kD)

2.5 间接EL ISA检测血清的抗体效价

用免疫前的兔血清为对照,纯化的ALC蛋白为抗原,免疫后的血清为一抗,HRP标记的羊抗兔抗体为二抗,间接 EL ISA法测定抗体效价.结果表明免疫后的抗血清效价达到1∶64 000以上((标本OD值-空白对照OD值)/(阴性对照OD值-空白对照OD值)≥2.1即P/N≥2.1为阳性).

2.6 ALC蛋白抗血清的Western Blotting分析

以纯化的ALC蛋白作为抗原,用制备的ALC抗血清为一抗,AP标记的羊抗兔IgG为二抗,常规方法进行Western Blotting印迹分析,与免疫前血清对照,呈现特异性条带(见图6A),结果表明抗ALC蛋白多克隆抗体可以与融合表达的尿囊酸酶蛋白特异性结合,与免疫前血清没有发生反应(见图6B),说明成功制备出尿囊酸酶多克隆抗体;诱导的菌体蛋白在62 kD有明显的杂交条带,而抗血清与未诱导的大肠杆菌全菌裂解液没有任何的杂交条带(见图6C),抗体仅特异地识别目的蛋白,说明制备的兔抗ALC多克隆抗体敏感性强、特异性高.

3 讨 论

从盘基网柄菌中提取和分离特定的尿囊酸酶蛋白来制备抗体有很大困难.为此我们针对尿囊酸酶基因的特点,设计了特定引物,克隆了尿囊酸酶的基因,扩增产物经测序鉴定,阅读框完整,表明成功克隆出allC基因,为后续ALC蛋白的正确表达和高效抗体的制备提供保证.

载体构建过程中,为了目的片段插入的准确性,引入中间载体pMD18-T Simp le Vector,该载体是一种高效克隆PCR产物的专用载体,结果表明通过引入中间载体,提高了产物的酶切效率和连接的准确性,因此是值得推荐的方法.

图6 抗血清特异性的Western Blotting分析(单位:kD)Fig.6 Western Blotting analysis of the specificity of antiserum(Unit:kD)

为了获得可溶性表达产物,我们曾采用较低的温度来表达尿囊酸酶产物,但在菌液上清中仍然难于找到尿囊酸酶蛋白,因此表达产物多以包涵体形式存在.我们分析这可能与ALC蛋白高效表达有关.在蛋白低表达时很少形成包涵体,表达量越高越容易形成包涵体,原因可能是合成速度太快,以至于没有足够的时间进行折叠,二硫键不能正确的配对,过多的蛋白间的非特异性结合;其次可能与尿囊酸酶蛋白氨基酸组成有关,盘基网柄菌尿囊酸酶有11个半胱氨酸,占整个氨基酸组成的3%,因为含硫氨基酸越多越易形成包涵体[12].本研究的目的就是要制备多克隆抗体,形成了包涵体反而利于制备抗体,因为包涵体里90%都是目的蛋白,同时还可以避免大肠杆菌内蛋白水解酶对目的蛋白的降解,有利于表达量的提高.

为了达到获得敏感性高、特异性强的抗体目的,我们用Ni-N TA亲和层析柱纯化目的蛋白,经SDS-PAGE检验证实只出现单一的目的条带,蛋白纯度达到95%以上.再采用切胶回收的方法进一步纯化ALC蛋白后免疫新西兰大白兔,获得的抗体效价达到1∶64000以上,较相关文献报道要高[13,14].我们用该抗体免疫盘基网柄菌发育细胞的全蛋白,获得良好结果(数据未显示).这为后续深入研究ALC蛋白在盘基网柄菌发育过程中的表达时间,细胞内定位,及其在盘基网柄菌细胞发育中的作用提供必要前提和有力工具,也为进一步探讨尿囊酸酶蛋白在gp150介导的细胞信号通路中的位置提供重要依据.

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Clone,expression of allan toicase gene from Dictyostelium discoideum and preparation of polyclonal antibody against ALC

CHEN Neng-xing, WEIXiao-jing, L IU Wei, HOU Lian-sheng

(School of L ife Science,East China N ormal University,Shanghai 200062,China)

Q255

A

1000-5641(2010)04-0077-08

2009-03

国家自然科学基金(30670266,30470200)

陈能星,男,硕士研究生.

侯连生,男,教授,研究方向为细胞粘附分子和细胞信号转导.E-mail:lshou@bio.ecnu.edu.cn.