实时定量PCR检测siRNA对小鼠巨噬细胞中FTH1基因表达的抑制作用*

杜军伟,王远志,陈创夫,葛阳春,唐利燕

2.新疆民族与地方高发病教育部重点实验室,石河子832003

实时定量PCR检测siRNA对小鼠巨噬细胞中FTH1基因表达的抑制作用*

杜军伟1,2,王远志2,陈创夫2,葛阳春1,2,唐利燕1,2

目的通过实时定量PCR(real-time PCR)检测基因表达的mRNA,建立一种直接观察小干扰RNA(siRNA)抑制目的基因表达的方法。方法化学设计合成对应于FT H1(ferritin heavy chain 1,FTH1)基因表达mRNA的siRNA,经TurboFectTMin vitro Transfection Reagent转染小鼠RAW264.7巨噬细胞,48h后,提取总 RNA,逆转录为cDNA。以 3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参,定量检测FTH1的表达,比较干扰前后FT H1基因mRNA的量。结果3种siRNA处理的小鼠巨噬细胞中FT H1基因的表达抑制率最高为97.60%。结论实时定量PCR方法的建立为研究布鲁氏菌在侵染巨噬细胞过程中FTH1的功能提供了有效途径。

实时定量PCR;siRNA;小鼠RAW264.7巨噬细胞;FT H1

2.新疆民族与地方高发病教育部重点实验室,石河子832003

布鲁氏菌病是严重危害畜牧业的动物源性传染性疾病,主要感染反刍动物和人类〔1〕。其病原为布鲁氏菌(Brucella),是一种兼性细胞内寄生的致病菌,人感染后常表现为持续性感染,可引发生殖系统损伤、脑膜炎、心内膜炎、关节炎等,甚至会丧失劳动能力〔2〕。家畜感染后造成流产、空怀等〔3〕,给畜牧业生产造成严重经济损失。巨噬细胞是布鲁氏菌生存和繁殖的靶细胞。IV型分泌系统(VirB)是布鲁氏菌毒力基因,与布鲁氏菌在宿主细胞内生存、复制有关。VirB区段包括 12个基因,形成一个操纵子。VirB系统的结构功能研究显示:VirB2和VirB5位于细菌表面,形成菌毛样结构〔4-5〕。王远志等〔6〕运用酵母双杂交技术从绵羊种布鲁氏菌019株侵染绵羊巨噬细胞的cDNA文库中成功的筛选出铁蛋白重链多肽(ferritin heavy chain 1,FT H1)与布鲁氏菌019株VirB5相互作用,但是FTH1在布鲁氏菌侵染巨噬细胞中的作用机制仍不清楚,本试验通过运用RNA干扰技术下调FTH1的表达,并运用荧光实时定量技术来检测干扰后FT H1基因mRNA的表达量。从而为下一步检测FTH1在布鲁氏菌侵染巨噬细胞中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器 小鼠RAW264.7巨噬细胞株购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库;宿主菌 DH5a由本实验室保存;RNAi表达载体RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen Vector试剂盒购自美国BD Bioscience Clontech公司;限制性内切酶MUL-I、反转录酶M-MLV购自大连生物工程有限公司;DMEM培养基、小牛血清购自GIBCO公司;TurboFectTMin vitro T ransfection Reagent转染试剂盒、Trizol购自Invitrogen公司;荧光定量PCR试剂盒购自博奥公司;无内毒素质粒大提试剂盒购自天根生化科技有限公司;其他试剂为国产分析纯产品。LSM510激光共聚焦显微镜:新疆地方与民族高发病教育部重点实验室;Smart CyclerⅡ实时定量PCR仪:Cepheid公司。

1.2 方法

1.2.1 表达FT H1的siRNA的设计 将小鼠FTH1基因(GenBank,No:NM_010239)提交到Ambion公司的 shRNA查找网站(http://www.ambion.com/techlib/misc/shRNA_finder.html),针对FTH1基因分别确定了3对阳性siRNA片段,1对与其它物种基因序列均无同源性的阴性对照序列,合成的siRNA对应的DNA序列如表1。

表1 合成shRNA对应DNA序列Tab.1 Synthesized DNA Sequence corelated to siRNA

1.2.2 RNA干扰FT H1基因的绿色荧光蛋白表达载体pSIREN-siRNA的构建 按照RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen Vector试剂盒说明书进行,将合成的 siRNA正反义链 DNA片段稀释到100 μ mol/L;按照摩尔比 1∶1 混合后,95℃ 30 s,72℃2 min,37℃2 min,25℃2 min,PCR仪上合成双链;稀释至 0.5 μ mol/L后,进行与 RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen Vector的连接,分别命名为pSIREN-A/B/C/D;挑取阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序,将鉴定正确的克隆菌,按照无内毒素质粒大提试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书大量制备质粒,-20℃备用。

1.2.3 转染 小鼠巨噬细胞RAW264.7用含10%小牛血清DMEM培养基(100U青霉素/mL、100U链霉素/mL),将处于对数生长期的细胞置于12孔细胞板中,在 37℃、5%CO2条件下培养24h后,用 TurboFectTMin vitro Transfection Reagent转染试剂按说明书进行转染,试验将pSIREN-D转染组设为阴性对照组。转染后5%CO2,37℃条件下培养48 h,用LSM510激光共聚焦显微镜观察细胞中的绿色荧光表达蛋白。

1.2.4 实时定量PCR引物设计 用Pimer 3.0软件分别针对目标基因FT H1、内参基因GAPDH设计实时定量引物,引物序列见表2。

表2 引物序列Tab.2 Primers sequence

1.2.5 pSIREN-siRNA质粒转染RAW264.7细胞对FTH1基因表达的作用 实时定量PCR检测转入干扰质粒后细胞中FTH1的拷贝数,将结果进行统计学分析。

2 结 果

2.1 RNA干扰FTH1基因的绿色荧光表达载体pSIREN-siRNA的构建结果 经上海生工生物工程技术服务有限公司测序,结果表明所插入的干扰片段分别与FTH1-A/B/C/D序列比对完全正确。2.2 pSIREN-siRNA质粒在细胞内荧光观察 运用TurboFectTMin vitro Transfection Reagent转染试剂盒的操作说明进行转染,在48h后用LSM510激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞中的绿色荧光表达蛋白,经多处采集信息计算出质粒的转染效率约等于100%,见图1。

图1 RAW264.7细胞转染pSIREN-siRNA表达质粒48h后的荧光照片1.1:48h;1.2:对照Fig.1 The fluorescence of RAW264.7 cells transfected with pSIREN-siRNA expression plasmids1.1:48 h;1.2:control cells.

2.3 实时定量PCR标准曲线的制作 GAPDH的标准曲线方程为:y=-0.22x+12.087,曲线的斜率为-0.22,相关系数为0.996,扩增产物的溶解曲线有一个主峰值,如图2。

FTH1的标准曲线方程为:y=-0.266x+13.163,曲线的斜率为-0.266,相关系数为0.983,扩增产物的溶解曲线有一个主峰值,如图3。

2.4 pSIREN-siRNA质粒转染RAW264.7细胞后干扰效果检测 以pSIREN-A/pSIREN-B/pSIREN-C/p-SIREN-D四个siRNA,分别对FTH1基因进行干扰(48h),实时定量 PCR检测干扰前后FTH1基因在细胞中的拷贝数,以相应的FTH1基因检测值/GAPDH的检测值作为校正值,再用公式干扰效率(%)=(RNAi阴性对照组-RNAi试验组)/RNAi阴性对照组×100%进行各个pSIREN-siRNA质粒干扰效果的检测比较。结果表明FTH1基因的3个试验组的siRNA干扰质粒都具有干扰效果pSIREN-A为57.60%,pSIREN-B为88.50%,pSIREN-C为97.60%。

3 讨 论

布鲁氏菌是细胞内寄生菌,Tsuji等〔7-8〕证实铁蛋白重链转录起始位点的上游有抗氧化反应元件,可对氧化反应做出应答,保护细胞免受氧化损伤。大量证据表明致病菌的致病力与其摄取铁的能力直接相关〔9〕,有效的铁摄取被看作是重要的致病因素,致病菌必须通过高度特异、有效的铁摄取系统完成铁的摄入〔10-11〕。

由于布鲁氏菌VirB5可以和巨噬细胞中的FTH1相互作用,我们可以推测,FTH1与VirB5结合,诱导布鲁氏菌IV型分泌系统将螯合的铁离子输入菌体内,提供细菌所需的铁,从而维持了细菌的毒力;另一方面,感染细胞中的FTH1摄取了胞浆内的游离铁,减少了二价铁离子对细胞的损伤,起到抗氧化作用,延缓了细胞的凋亡,从而使布鲁氏菌在巨噬细胞内长期生存。在本试验中,针对FT H1设计干扰质粒,转染RAW264.7巨噬细胞,在48h后用LSM510激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞中的绿色荧光表达蛋白,经多处采集信息,质粒的转染效率接近于100%。通过实时定量PCR检测,siRNA干扰质粒pSIREN-C对FTH1基因表达的抑制率最高达到了 97.60%,具有较好的沉默效率,能高效、靶向性降低FT H1基因的表达。通过这一结果,我们可以推测:FT H1基因的表达降低可能会削弱胞内布鲁氏菌的毒力,并造成巨噬细胞中的游离铁离子增多,细胞抗氧化能力减弱,避免了布鲁氏菌在巨噬细胞内的长期寄生。通过本试验为研究新型的药物来控制布鲁氏菌,对巨噬细胞的入侵以及为研究布鲁氏菌胞内寄生机制奠定基础。

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Detection of inhibitory effect of siRNA on FTH1 gene expression of mouse RAW264.7 macrophages with rea1-time PCR

DU Jun-wei1,2,WANG Yuan-zhi2,CHEN Chuang-fu2,GE Yang-chun1,2,TANG Li-yan1,2

(1.College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi832003,China;
2.Ministry of Education Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease,Shihezi832003,China)

The aim of the present study was to establish an assay of real-time PCR to detect the inhibitory effect of siRNA on gene expression.The chemically synthesized siRNAs matched with ferritin heavy chain 1(FTH1)mRNA were transfected into RAW264.7 macrophages with TurboFectTMin vitroTransfection Reagent.Then the total RNA was extracted from the cells and reversely transcribed into cDNA.The expression of FTH1 was quantified and compared by real-time PCR on the basis of expressions of g1yceraJdehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)as internal control in different groups.Three kinds of siRNAs could significantly inhibited FT H1 mRNA expression in mice RAW264.7 macrophages and the inhibition rate reached to 97.60%.Results demonstrated that the built real-time PCR could be employed in detection of FTH1,which provides a method to study FTH1 function in the course ofBrucellainfection.

real-time PCR;siRNA;mice RAW264.7 macrophage;FTH1

R378.5

A

1002-2694(2010)07-0638-04

*国家自然科学基金(30800813),兵团博士基金(2009JC15),高层次人才科研启动资金专项(RCZX200828)和973项目(2010CB530200)联合资助

王远志,Email:wangyuanzhi621@126.com

陈创夫,Email:ccf-xb@163.com

1.石河子大学动物科技学院,石河子 832003;

2009-11-10;

2010-03-22