B7-H4与移植免疫

金成彦,姜 睿,赵吉光,孙 梅,李金东,张兴义*

(1.吉林大学白求恩第二医院 胸外科,吉林长春 130041;2.吉林大学中日联谊医院 骨科;吉林 长春 130033;3.吉林大学白求恩第二医院 心血管内科,吉林 长春 130041;4.吉林大学白求恩第二医院 病理科,吉林 长春 130041)

B7-H4与移植免疫

金成彦1,姜 睿2,赵吉光3,孙 梅4,李金东1,张兴义1*

(1.吉林大学白求恩第二医院 胸外科,吉林长春 130041;2.吉林大学中日联谊医院 骨科;吉林 长春 130033;3.吉林大学白求恩第二医院 心血管内科,吉林 长春 130041;4.吉林大学白求恩第二医院 病理科,吉林 长春 130041)

B7-H4是2003年发现的B7家族成员,在T细胞介导的免疫中起负调节作用,抑制T细胞增殖和细胞因子分泌。尽管其mR NA在淋巴组织和非淋巴组织均有表达,但其蛋白质在正常组织、细胞中不表达或极低表达。本文就B7-H4与移植免疫的相关研究进展作一综述。

B7-H4;共刺激分子;移植;免疫学

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0954)

在T细胞活化和耐受的免疫调节中,CD40:CDL,尤其是B7:CD28及家族成员介导的T淋巴细胞共刺激信号传导途径起着至关重要的作用。它们不仅在启动、增强和维持T细胞应答中提供了关键的正性信号,而且还可提供重要的负性信号来限制、终止或削弱T细胞的免疫应答。T细胞活化需要识别双信号系统,即MHC-抗原肽提供的第一信号和共刺激分子提供的协同刺激信号。第一信号具有抗原特异性;第二信号是非抗原特异性的,但是T细胞抗原特异性激活所必需的,它决定抗原刺激的T细胞是进入增殖、分化过程成为效应细胞,还是进入无反应状态或凋亡。共刺激分子中有正性和负性分子之分。免疫活化及反应过程中,T细胞表达受体同时接受正性和负性共刺激信号,免疫反应的最终结局取决于免疫刺激和抑制系统平衡的结果,即正性和负性共刺激分子之间的平衡(图1)。这些共激活分子多属于B7分子。B7类分子属于免疫球蛋白超家族,成员间根据其氨基酸序列和蛋白质结构的特异性相互区别。B7类分子胞外区含有单一IgV和IgC结构域,并且有20-40%氨基酸相同,与T细胞表面其相应受体结合后,在抗原特异性免疫应答过程中发挥正性或负性调控作用。在病毒感染、肿瘤、移植免疫排斥以及自身免疫性疾病过程中适当地调节或干预这些共刺激信号,将有助于这些疾病的治疗及改善疾病症状。

图1 移植免疫应答

近几年,随着新的共刺激信号分子不断被发现及相关功能研究进展,B7:CD28家族成员迅速增加。这些新成员包括 B7-H1/B7-DC/PD-1、B7-H2/ICOS、B7-H3、B7-H4和 BTLA 等。B7-H4(又称 B7S1和B7x)是B7:CD28家族中的最新发现的一个成员,它能通过抑制T细胞的增殖、细胞因子的产生和细胞周期的进程来负性调控T细胞的免疫应答,而且在外周免疫耐受中可能具有非常重要的作用。本文就B7-H4与移植免疫的相关研究进展作一综述。

1 B7-H4的结构及功能特点

2003年,Chen等三个实验室利用生物信息学的方法相继发现了B7-H4分子这个B7家族新成员。他们是以现有的B7家族成员的胞外段可变区(IgV+IgC)为查询序列,对GenBank中的EST序列(表达序列标签)进行搜索时发现的,并在人胎盘cNDA文库中得到了全长序列。人B7-H4的cDNA长约1.8 kb,位于人的染色体1p11.1,在基因组上跨越66 Kbp,含有6个外显子和5个内含子。第6个外显子存在两种可变剪切形式,由此产生两种不同的剪切本。此外,在人染色体20p11.1有一个假基因(pseudogene),它在编码区仅含有一个外显子和两个终止密码子且与编码B7-H4的cDNA在核酸水平的相似性高达94%。两者之间在序列上的差异主要在IgV和IgC区。两个终止密码子分别位于第21位和540位,这两个点分别为信号肽区和跨膜区的外侧,阻止了全长B7-H4蛋白的合成。因此,这个可变的B7-H4基因组DNA被认为是B7-H4的假基因。这个假基因的功能尚未明了,但据最近的报道所述能表达的假基因在调控与它同源的编码基因mRNA的稳定性上起着重要的作用。

B7-H4表达在专职APC,并广泛分布在非淋巴组织上。RT-PCR分析示,在胎盘、肝、骨骼肌、肾、胰腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠,有其mRNA表达。然而,用人B7-H4特异性单克隆抗体进行免疫组化,从正常来源的上述组织中未发现阳性结果。流式细胞术(FACS)分析示,新鲜分离的T细胞、B细胞、单核细胞、DC表面无B7-H4表达,在体外刺激后,能被诱导表达。FACS和RT-PCR显示,即使在用TNF-α和IFN-γ刺激后,人主动脉内皮细胞也不表达B7-H4。鼠组织Northern杂交分析显示,据组织类型的不同,mB7-H4有4个不同的转录本。鼠B7-H4转录本在心脏、肺、肝、骨骼肌、肾、睾丸能检测到,但在脑、脾未检测到[1]。Chen等在人的B7-H4分子被鉴定的基础上,利用类似的生物信息学的方法找到了小鼠的B7-H4分子,该分子在蛋白结构上与人B7-H4同源性高达87%,位于小鼠3号染色体上有6个编码区。

B7-H4基因有两个不同的转录产物,分别为2.0 kb和800 bp,共同存在于各种组织中,不具有组织特异性。B7-H4(2.0 kb)的表达水平高于B7-H4(800 bp),两者与全长B7-H4 cDNA同源,包含外显子I至V,B7-H4(800 bp)是外显子VI被部分剪接的产物。B7-1和B7-2经选择性剪接得到某些跨膜区缺失的蛋白质分子,与此剪接机制不同,两种B7-H4分子的跨膜区均保持完整,只是3'非翻译区不同,可能影响B7-H4基因的翻译效率[2]。

B7-H4 mRNA存在许多人体组织和器官中,如胎盘 、肾 、肝 、肺 、卵巢 、睾丸 、脾等 ,但在脑组织和心脏未发现其表达。B7-H4在非淋巴组织中表达说明其可能在这些组织中起到调控免疫应答的作用。在胸腺中的少量细胞,如CD4、CD8等细胞中可以检测到B7-H4表达,而在B220+脾细胞中,B7-H4基因则呈现组成性表达的特点,另外B7-H4还表达于CD11b+巨噬细胞和骨髓来源的CD11c+树突状细胞,B7-H4在大量专职抗原提呈细胞表达特征说明其可能参与调节T细胞免疫应答[3]。RT-PCR显示,在所有组织中均检测到mRNA。尽管B7-H4的mRNA广泛的分布于正常组织,然而免疫组化研究显示正常人的组织、器官表达均阴性表明,正常外周组织能在转录水平对B7-H4的表达进行严密的调控,同时提示该分子的表到可能具有重要功能[4]。已发现,一些肿瘤细胞也呈组成性表达B7-H4,如卵巢癌[5]和肺癌细胞[6]、乳腺癌细胞[7]等。此外,小鼠脾细胞组成性表达B7-H4,而活化后则下调表达。对小鼠组织的Northern blot实验发现,根据组织类型的不同,小鼠的B7-H4共有4种不同的mRNA剪切形式。肝组织拥有这四种剪切形式的高水平表达,它们的大小分别为715 kb,4 kb,216 kb和118 kb。高灵敏的RT-PCR分析显示,人类的组织至少拥有两个转录本[2]。

1.1 B7-H4与调节性T细胞

调节性T细胞的免疫抑制作用机制有很多种,IL-10介导的复杂作用是其中的一种。通过研究调节性T细胞与抗原呈递细胞(Antigen presenting cells,APCs)的相互作用,发现调节性T细胞会触发APCs分泌大量的IL-10,IL-10可以诱导APCs细胞表达大量的B7-H4,导致APCs产生免疫抑制。敲除APCs上的B7-H4,可以抑制调节性T细胞介导的APCs的免疫抑制作用。由APCs细胞分泌的IL-10可以刺激其本身表达更多的B7-H4,这是最新发现的调节性T细胞介导的免疫抑制机制,这种机制是在APCs水平上发挥作用。实验证明,B7-H4在APCs上过表达,产生了“调节性APCs”,从而抑制了免疫应答反应。为了进一步研究在肿瘤环境中的B7-H4、巨噬细胞、调节性T细胞之间的病理关系,KryczekI等对103个患者体内卵巢癌细胞和卵巢癌相关巨噬细胞上的B7-H4表达量进行了统计,观察到巨噬细胞上的B7-H4的密度与调节性T细胞上的数量正相关,且调节性T细胞的数量和B7-H4的表达量与卵巢癌患者的预后呈负相关。同时,调节性T细胞能通过促使巨噬细胞自分泌IL-10和IL-6,刺激B7-H4在巨噬细胞上表达增多,通过B7-H4的作用,调节性T细胞将抑制信号传递给APCs(巨噬细胞来源)[3]。

1.2 B7-H4与B细胞

众所周知,B7家族的共刺激分子在调节T细胞免疫应答中起着重要的作用。如B7-1和B7-2与CD28结合时,可以发挥正性的刺激作用,当B7-1和B7-2与CTLA-4结合时,发挥着抑制性作用。然而,B7家族共刺激分子如何调节B细胞的功能却知之甚少。有-些研究证明,经过LPS和CD40的刺激可以诱导B细胞表面B7家族分子的表达,激活B细胞。SuvaS等证明了表达在细胞表面的B7家族分子,对正常的B细胞和B细胞淋巴瘤都发挥着重要的作用,因此可以认为B7家族分子在决定B细胞的最终命运上发挥着重要的作用[2]。

1.3 B7-H4在巨噬细胞表面的表达

经过对抑制性免疫细胞数十年的研究,人们对主要的免疫抑制性细胞CD4-CD25+调节性T细胞的功能了解已经比较透彻。最近在卵巢癌患者体内又发现了一群新的免疫抑制性细胞,称为B7-H4+肿瘤相关巨噬细胞。肿瘤相关巨噬细胞是卵巢癌间质中的重要组成成分,且与肿瘤的进程密切相关[8]。且现在多数B7-H4的实验都集中于肿瘤方面。

1.4 B7-H4的功能—负性调节T细胞的活化

目前大量的研究表明B7-H4负性调节T细胞的活化。Sica等通过固相化的抗CD3单克隆抗体模拟抗原对T细胞的第一信号,从而分析了B7-H4交联对T细胞激发作用,结果表明B7-H4抑制了T细胞反应。在该实验中作者采用用固相化的抗CD3单抗作为抗原模拟刺激,检测B7-H4与T细胞反应之间的关系。抗CD3单抗能刺激从DO11.10转基因小鼠新鲜分离的幼稚CD4+T细胞增殖,且呈剂量依赖关系。在培养开始加入固相化的mB7-H4-Ig明显抑制T细胞增殖,而对照Ig无此作用。B7-H4-Ig也明显抑制了IL-2和IL-10的产生。可溶性B7-H4-Ig虽然不能抑制T细胞增殖,但在体外实验中,却能部分抑制同种反应性细胞毒性T细胞(CTL)的产生。除上述作用外Sica等还发现B7-H4能够负性抑制B7-CD28共刺激作用。B7-CD28是T细胞增殖的早期活化信号。研究证实,B7-H4诱导的T细胞增殖和IL-2分泌的抑制效应仅能部分被CD2信号所逆转。这也表明B7-H4是T细胞的一个强有力的减弱因子[3,4,9]。B7-H4的信号途径与CTLA-4信号途径颇为相似。CFSE(羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)标记的T细胞与固相化的抗CD3mAb和B7-H4-Ig融合蛋白共培养后,流式细胞仪分析发现在单独CD3mAb刺激下T细胞在48小时出现了适度的细胞分裂,96小时约有70%的细胞发生超过了4次的分裂。而在同时加入B7-H4-Ig实验组的T细胞在48-96小时却发生了显著的细胞分裂抑制,分裂峰细胞比例的下降和分裂峰数目的减少。更进一步的研究显示B7-H4能把T细胞抑制在细胞周期的G0/G1期,但并不明显促进T细胞凋亡[3,9]。B7-H4对T细胞增殖的抑制可能是通过IL-2依赖的机制。这可表现在外源性IL-2能逆转B7-H4-Ig诱导的增殖抑制作用。至今B7-H4作用的确切机制尚不明确,但已有的研究发现活化的T细胞在B7-H4的作用下,JunB分子呈明确下调表达。而JunB分子的作用之一是在T细胞活化后诱导调节IL-2的转录水平[3]。而B7-H4Ig的存在明显抑制了增殖和IL-2分泌。B7-H4-Ig能抑制B7-H1共刺激的T细胞分泌IL-2、4、10和 IFN2-γ。结果显示B7-H4诱导的 T细胞增殖抑制不能被CD28共刺激所逆转。B7-H4具有选择性的阻断某一途径的作用。将B6小鼠脾细胞输入亚致死剂量照射的BDF1(B6×DBA/2),后者用B7-H4-Ig处理,发现B7-H4-Ig明显减少了针对P815细胞的CTL活性,B7-H4-Ig在体内能抑制CD8+CTL的增殖和成熟[4]。

1.5 B7-H4的可能受体—BTLA

BTLA(B和T淋巴细胞衰减子)的分子,可能是B7-H4在活化T细胞上的受体。BTLA作为CD28家族的新成员表达于活化T细胞和静止B细胞,在其胞质尾区有两个ITIM并可能通过该结构抑制T细胞反应。然而,迄今唯一提示BTLA是B7-H4受体的现象是B7-H4-Ig融合蛋白可以与野生型T细胞而不能与BTLA缺陷T细胞结合[10]。但这仅只能作为间接证据,因为B7-H4的受体有可能是因为缺乏BTLA而被下调或者BTLA影响B7-H4与其特异受体的结合表面。但另有实验表明,BTLA不是B7-H4的受体[11]。BTLA是否为B7-H4受体尚需进一步实验来验证。

2 B7-H4与移植免疫

已知B7-H4能抑制效应性T细胞的增殖,减少细胞因子 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的生成,抑制免疫应答[12,13],钱韵等在实验中用表达的mB7-H4与经CD3刺激的T淋巴细胞共同培养,并通过CCK-8、ELISA等方法分别检测T细胞增殖情况及细胞因子(如 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ)的分泌变化 。活性鉴定结果表明,加入Ppic9-mB7-H4转染酵母提取的蛋白的实验组与经CD3诱导的其他对照组相比,显著地抑制T细胞的增殖和细胞因子的分泌,尤其是IL-2和IFN-γ的分泌水平。而与未经CD3诱导的T细胞组相比,没有明显的统计学意义,表明表达的mB7-H4具有抑制活化T细胞的生物学活性,进一步证明了mB7-H4重组酵母表达质粒的成功构建与mB7-H4重组蛋白的成功表达。mB7-H4表达质粒的成功构建与mB7-H4重组蛋白的成功表达为研究B7-H4的理化性质、生物学活性及单克隆抗体制备提供了条件[14]。

迄今,利用B7-H4修饰的细胞或蛋白产物,观察移植免疫耐受方面的报导不多。有实验室培育并鉴定出B7-H4基因敲除小鼠,实验证明:该小鼠在抵抗感染时可产生强烈的Th1反应并产生大量IFN-γ,即小鼠B7-H4分子确实在免疫反应中发挥负向调节作用,不过这种基因缺陷所体现对小鼠免疫系统的影响仅限于一定的免疫环境下,因为在多种因素影响的免疫反应中,其他负向调控分子的作用可能掩盖B7-H4基因缺陷所表现出的效应[15]。

人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)能够抑制T细胞活化和增殖,但其机制尚未明确。Woong-Kyung等在实验中调查了负面刺激分子B7-H4对T细胞活化hBMSCs免疫效果的作用,结果表明,B7-H4表达对hBMSCs通过抑制细胞周期阻滞和抑制因子诱导T细胞活化和NF-κ B核转位。阻断B7-H4将减少活化的T细胞上清与hBMSCs共同培养的TGF-β1(转化生长因子-β1)。明确了B7-H4分子可以抑制hBMSCs对T细胞的活化与增值。这些结果强调,hBMSCs在调节免疫反应的作用及在移植治疗应用的可能性,移植治疗抗宿主病(GVHD)和自体免疫疾病[16]。

有实验室报道了关于注射人B7-H4-Ig融合蛋白抑制移植排斥反应的研究,实验发现B7-H4-Ig融合蛋白以剂量依赖方式抑制T细胞的活化和IL-2的产生,在GVHD模型中,B7-H4-Ig可有效地抑制CTL的增殖、分化和成熟,从而延长小鼠的寿命[17]。另-项新的研究报道了在胰腺β细胞中转基因表达共刺激分子CD154可加速单个核细胞性胰岛炎(包括DC、T细胞、B细胞)进程,随即导致β细胞功能缺陷,表明将免疫共刺激分子的基因转染胰岛细胞后可获得有效表达,并进一步诱导相应免疫效应的增强。这提示使胰岛细胞携带并表达负向调控分子B7-H4,可能有效诱导特异性免疫耐受以保障移植物的存活,并可能有助于抑制 IDDM的发生和发展[18]。

在针对B7-H4的细胞移植实验中,研究人员构建了B7-H4-hrGFP重组质粒并转染原代培养胰岛细胞,制备B7-H4修饰的胰岛细胞,利用RT-PCR法获得小鼠B7-H4基因的特异性片段,经双酶切后与质粒rAAV-IRES-hrGFP连接,成功构建表达该目的基因的重组质粒mB7H4-hrGFP,纯化出胰岛细胞,将重组质粒 mB7H4-hrGFP转染胰岛细胞。再将B7-H4基因修饰的胰岛细胞移植给STZ诱导建立的同种异体糖尿病小鼠模型,缓解糖尿病症状,调节血糖至正常水平,与对照组相比,明显延长了移植胰岛的平均存活期,并得出B7-H4基因修饰的胰岛细胞在体外刺激T淋巴细胞增殖的能力显著下降,并可明显抑制IL-2、IFN-γ分泌的结论[19]。但移植组小鼠未能得到长期生存,可能与B7-H4有与其他受体结合可能或其他信号传导路径尚未被发现。

3 展望

共刺激分子为移植免疫耐受的实现提供了崭新的前景,成为目前的研究热点。B7家族是最重要的共刺激分子,而B7-H4作为近期研究的热门,通过负性共刺激通路抑制免疫排斥反应,并已在细胞实验中取得了一定的成功。现阶段对B7-H4在移植免疫方面的研究还不多,但随着对共刺激通路研究的深入,B7-H4必将成为新的移植排斥研究热点。

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B7-H4 and transplantation immunology

JIN Cheng-yan1,JIANGRui2,ZHAOJi-guang3,et al.(Dept.of ThoracicSurgery1Cardiology3,and Pathology4,and the Second Bethune Hospital of Jilin University,Changchun130041,China.Dept.of Orthopediac Surgery2,Sino-Japan Union Hospital of Jilin University,Changchun130033,China)

B7-H4,a B7 family member,which was found in 2003 plays negatively regulating effect of T-cell mediated immune response via inhibiting T-cell proliferation and cytokines production.Although B7-H4 mR NA expression is seen in lymph and nonlymph tissues,protein is down-expressed or not expressed in normal tissues and cells.This study is to review advances in B7-H4 associated-transplantation immunology.

B7-H4;co-stimulating molecule,transplantation,immunology

R446.6

A

1007-4287(2010)06-0954-05

国家自然科学基金资助(合同号:30870354);吉林省科技厅资助(合同号:20070720;200805120);吉林省发展与改革委员会资助(合同号:2009Y042J12314);吉林省卫生厅科研资助(合同号:20089002);2007年吉林大学科研种子基金资助

*通讯作者

金成彦(1982-),男,医师,主要从事胸外科及移植研究;张兴义(1963-),男,教授,博士生导师,主要从事肺癌和食癌外科及器官移植研究。

2010-03-18)