多重PCR检测急性反复上呼吸道感染儿童病毒和非典型细菌

范世珍,刘牧军,罗光亮,孙海峰

(1.深圳市福田区中医院 检验科,广东 深圳 518034;2.吉林大学第二医院 放射线科,吉林长春 130041)

多重PCR检测急性反复上呼吸道感染儿童病毒和非典型细菌

范世珍1,刘牧军1,罗光亮1,孙海峰2*

(1.深圳市福田区中医院 检验科,广东 深圳 518034;2.吉林大学第二医院 放射线科,吉林长春 130041)

*通讯作者

急性反复上呼吸道感染是住院儿童中最常见的疾病。有报道其发病率占所有儿科住院病人的38%,5岁内儿童的63%[1]。引起急性反复上呼吸道感染以细菌和病毒最常见。目前诊断病毒感染的常见方法是取鼻咽抽吸物进行免疫荧光试验[2],该方法能诊断数种病原体,如A、B型流感病毒,1、2、3型副流感病毒,呼吸道合胞病毒以及腺病毒等。但此方法检出率低,仅20%左右。另一种方法是分离培养,缺点是耗时,对于难培养的病毒显得无能为力。自从流感病毒H1N1爆发以来,一种快速、高敏感性的诊断方法显得非常迫切。

多重PCR(multiplex PCR)能在同一反应试管内同时检出多种病原体,能为临床提供更多更准确的诊断信息[3,4]。本研究通过运用多重PCR对186例急性反复上呼吸道感染儿童标本中病毒及非典型细菌进行了检测,报道如下。

1 材料和方法

1.1 病人的选择

本研究的186例急性反复上呼吸道感染的儿童均为2007年4月-2009年3月我院儿科的住院患者,年龄均不超过12岁。研究过程中均与儿童父母签署知情同意书。急性反复上呼吸道感染按1987年成都会议诊断标准,即0-2岁上感次数7次/年,5-6岁 6次/年,6-12岁 5次/年以上;突然发病(＜36 h),并至少有以下1项症状或体征:咳嗽,咽喉疼痛,耳痛,声音嘶哑,喘鸣/哮鸣音,呼吸困难或伴发热。

1.2 cDNA合成与多重PCR

无菌条件下获取病人双份标本(鼻咽抽吸物,鼻咽拭子)用于核酸提取。用于标本中病原体RNA或DNA的试剂盒购自Qiagen公司。模板提取按照试剂盒的说明进行。合成的cDNA储存于-20℃用于多重PCR分析。本实验共采用5组套式PCR引物用于检测20种呼吸道病毒和非典型性细菌。第1组引物用于扩增A、B流感病毒和H1、H3、H5亚型。第2组引物用于扩增 1、2、3、4型副流感病毒。第 3组引物用于A、B型呼吸道合胞病毒、鼻病毒、肠道病毒的检测。第4组引物用于扩增冠状病毒OC43,229E,SARS-CoV,以及变性肺病毒。第5组引物包括肺炎支原体、肺炎嗜衣原体,嗜肺军团菌,腺病毒。扩增条件按照参考文献提供的方法进行[2]。本实验用的PCR仪为Eppendorf公司梯度PCR仪。

2 结果

本研究当中,共检测出81例患者至少有1种病原体阳性(44%,81/186),其中鼻咽抽吸物中检测出78例(41.9%,78/186),略高于鼻咽拭子(38.2%,71/186),经χ2检验两者无统计学差异(P＞0.05)。

所有81例阳性患者检测出的病原体中,以流感病毒,副流感病毒,呼吸道合胞病毒,肺炎支原体最常见,占70.4%(57/81)。其中1种病原体感染67例(占82.7%),13例患者存在2种病原体感染,包括:2例患者变性肺病毒合并肺炎支原体感染,2例患者腺病毒合并肺炎嗜衣原体感染,2例患者肺炎支原体合并肺炎嗜衣原体感染。1例患者同时伴有呼吸道合胞病毒、鼻病毒、肺炎嗜衣原体感染。在所有混合感染儿童中,肺炎支原体、肺炎嗜衣原体、腺病毒是混合感染中最常见的病原体。在本研究中尚未检测出冠状病毒如SARS等,见表1。

表1 81例阳性病例的病原体感染情况

3 讨论

PCR技术因其快速、简便、特异且敏感,因此在临床上得到了广泛的应用。特别是难以培养的病原体,如肺炎嗜衣原体、肺炎支原体等,PCR技术也许是唯一可行的方法[5]。PCR技术根据检测的通量,可分为普通PCR(单一PCR)和多重PCR。普通PCR仅应用一对引物,通过PCR扩增产生一个核酸片段,主要用于单一病原体的鉴定。但在临床上,如急性反复上呼吸道感染,通常是由多种病原菌引起的混合感染,因此快速诊断并鉴定病原体的类型,对正确使用抗生素以及防止疾病的传播具有重要意义。

在本研究中采用多重PCR从186例急性反复上呼吸道感染儿童中检测出20余种呼吸道病毒和非典型细菌,共检测出81例,检出率达44%,与国内外报道接近[1]。尽管从本研究选取的样本来看,鼻咽抽吸物略高于鼻咽拭子,但经统计学分析两种不同的取材方法的检出率无明显差别。从检测出的病原体来看,病毒最常见,而平时难以培养的肺炎支原体、肺炎嗜衣原体,在本研究过程中也具有一定的阳性率,但在许多患者中表现为混合感染。

与单一PCR相比,多重PCR的另一优势是能大大缩短每种病原体单一PCR的检测时间。通常情况下,单一PCR的反应时间为35 min-3 h,而多重PCR能在1d内同时完成近20种病原体的检测[5]。因此从某种意义上讲,能减轻患者及家属的焦虑情绪,减少其住院时间。尽管多重PCR具有很多优势,但其敏感性和特异性通常情况下略逊于单一PCR,且费用较后者高[6],又只在医院或专业的实验室开展,这可能是限制其广泛应用于临床的重要原因。

总之,本研究通过多重PCR对急性呼吸道感染儿童病原体的检测,为流行病学研究提供了新的方法。当然,要诊断某病原体感染,单纯靠一个多重PCR的阳性结果不能完全说明问题,还需要其他诊断方法的补充。迄今为止,多重PCR方法难以在临床广泛开展,但近年来突发性疾病的广泛流行,如2003年SARS及2009年流感病毒H1N1的爆发,这给疾病的监测带来了新的挑战,因此深入探索快速、高通量的检测方法势在必行。

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1007-4287(2010)06-0890-02

2009-05-29)