多核白细胞弹性蛋白酶对人角膜基质细胞MMP-2 、MMP-9 表达的影响

刘泊明,张冰洁,杨 贲,郝继龙*

(1.伊通满族自治县第一人民医院眼科,吉林伊通 130700;2.吉林大学中日联谊医院眼科,吉林长春 130033)

多核白细胞弹性蛋白酶对人角膜基质细胞MMP-2 、MMP-9 表达的影响

刘泊明1,张冰洁2,杨 贲2,郝继龙2*

(1.伊通满族自治县第一人民医院眼科,吉林伊通 130700;2.吉林大学中日联谊医院眼科,吉林长春 130033)

目的观察多核白细胞弹性蛋白酶与白细胞介素-1α对人角膜基质细胞表达的MMP-2、MMP-9的影响,进而探讨角膜溃疡的发生机理。方法体外培养人角膜基质细胞,在培养液中添加或不添加多核白细胞弹性蛋白酶或白细胞介素-1α,培养5天,通过明胶酶谱分析的方法测定培养上清中的MMP-2和MMP-9的表达。结果体外培养的人角膜基质细胞无任何刺激下可释放MMP-2;白细胞介素-1α可加强并激活MMP-2的表达,同时可诱导MMP-9前体的释放;多核白细胞弹性蛋白酶在白细胞介素-1α诱导下可完全激活前体MMP-9转化为活化形式。结论多核白细胞弹性蛋白酶和白细胞介素-1α协同作用参与角膜溃疡的发生。

多核白细胞弹性蛋白酶;白细胞介素-1α;角膜基质细胞;MMP-2;MMP-9

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0855)

角膜溃疡是指角膜组织缺损超越前弹力层、伴有角膜基质溶解的病理状态,角膜基质的溶解是由于角膜细胞外基质蛋白以及I型胶原和蛋白多糖的过度降解造成的,白细胞浸润参与这一过程,多核白细胞可以通过释放过氧化氢、自由基、弹性蛋白酶、组织蛋白酶、胶原酶和明胶酶等导致病理性组织损伤,而其中的多核白细胞弹性蛋白酶可降解许多种细胞外基质蛋白如弹性蛋白,糖蛋白,胶原,纤维连接蛋白等[1]。角膜基质细胞可产生多种类型的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)[2],这些MMP均以酶原即潜酶的形式分泌到细胞外,需在细胞外经酶活化之后才能发挥其酶的作用。本文利用明胶酶谱法观察多核白细胞弹性蛋白酶(neutrophilelastase,NE)在白细胞介素-1α(Interleukin-1α,IL-1α)介导下对人角膜基质细胞MMP-2和MMP-9的影响。

1 材料与方法

1.1 人角膜基质细胞的分离培养及鉴定

人角膜取自于意外死亡的眼球捐献者,供体角膜中央部分用于穿透性角膜移植,残余周边部分用于本试验。按我们以前报告的方法[3]将供体角膜残余部分自角膜缘内1 mm剪开,去除角膜缘及巩膜部分,刮除角膜上皮及内皮,角膜基质以胶原酶消化,分离角膜基质细胞,原代培养于含10%胎牛血清MEM培养液中,传代培养4-5代的细胞用于实验。

1.2 人角膜基质细胞的鉴定

实验前倒置显微镜下观察角膜基质细胞形态,细胞的鉴定采用抗Vimentin抗体(非上皮细胞标志)、抗Cytokeratin抗体(上皮细胞表面标志)、抗α-SMA(肌样成纤维细胞表面标志)行免疫染色[4]。

1.3 明胶酶谱法测定MMP-2和MMP-9的表达

将角膜基质细胞以0.25%胰酶消化后制成细胞悬液,稀释至约1×104/mL后置入6孔板培养至80%融合,之后换成不含有血清的MEM培养液培养1天,使细胞达到同步化。添加或不添加多核白细胞弹性蛋白酶(30 nm,Sigma,美国)及 IL-1α(0.3 ng/ml,Genzyme,美国)的无血清MEM 培养液培养5天。收集上清液,根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度,加入非还原十二烷基硫酸钠(SDS)样品缓冲液(125mM Tris-HCl[pH6.8],20%甘油,2%SDS,0.002%溴酚蓝)。配制含0.1%明胶的10%SDS聚丙烯酰胺凝胶,在4℃进行十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)[5]。凝胶在2.5%的Triton X-100中振荡洗脱1 h,放入孵育液(50 mM Tris-HCl[pH 7.5]、5 mM CaCl和1%TritonX-100)中37℃中18 h。最后用考马斯亮蓝R250染色,脱色剂脱色至蓝色背景下可见清晰白色条带。

2 结果

如图所示,在无角膜基质细胞的情况下,上清中无论是否添加多核白细胞弹性蛋白酶及IL-1α均不能检测到MMP-2或MMP-9的存在。角膜基质细胞在无任何刺激下可释放前体MMP-2(72 kD)和活化形式的MMP-2(66 kD);添加IL-1α后可增加并激活MMP-2的表达,同时诱导前体MMP-9(92 kD)的释放;同时添加多核白细胞弹性蛋白酶及IL-1α时可将前体MMP-9(92 kD)完全转化为活化形式的MMP-9(83 kD)。

图1 中性粒细胞弹性蛋白酶和IL-1对角膜基质细胞胶原酶活性的影响

3 讨论

角膜溃疡是由于角膜基质胶原和糖蛋白的过分溶解所致,角膜基质细胞是角膜组织中重要的细胞成分,它所产生的MMP在细胞外经酶活化之后发挥作用。MMPs是一组结构和功能相关的锌依赖性内肽酶,MMP如果过度表达,可以引起基质胶原的过度降解、形成角膜溃疡[2],其中最重要的是胶原酶和明胶酶,MMP-2和MMP-9属后者,MMP-2被称为明胶酶A,MMP-9称为明胶酶B。MMP-2是家族中含量最丰富、分布最广的一种,它与MMP-9因优先降解基底膜成分如Ⅳ型胶原,是目前眼组织中研究得比较广泛的MMP成员[6]。现已证实在角膜炎[7]、角膜碱烧伤[8]、角膜移植排斥反应[9]中MMP-2、MMP-9的表达均增加并被激活。MMP-2是正常角膜细胞产生的主要蛋白酶,在正常角膜内主要以酶原形式存在,起着“监视”功能,当机体受到炎症反应等刺激时,MMP-2被激活释放催化胶原降解[10]。我们以前的实验已证实存在纤维溶酶原的情况下,IL-1α促进角膜基质细胞的胶原降解[11]。Geraghty等报道多核白细胞弹性蛋白酶可增加人巨噬细胞表达前体和活化形式的MMP-2[12]。Itoh等也报道了多核白细胞弹性蛋白酶能降解与MMP-9结合的TIMP-1,但不破坏MMP-9,可作用于MMP-9使之被活化为分子量82 kD的片断[13]。这些都与本文得到的结果一致,角膜基质细胞可释放MMP-2(前体和活体形式);添加IL-1α后可激活MMP-2,同时诱导前体MMP-9释放;多核白细胞弹性蛋白酶在IL-1α的诱导下可完全激活前体MMP-9转化为活化形式,这些均提示弹性蛋白酶和IL-1α在角膜溃疡的发生中起着重要的作用,并且二者有协同作用。

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Effects of neutrophil elastase on expression of the MMP-2,9 in cultured human corneal fibroblasts

LIU Bo-ming1,ZHANG Bing-jie2,YANGBen2,et al.(1.Departmentof Ophthalmology,The firstpeople's hospitalofYitongManchu AutonomousCounty,Jilin Yitong130700,China;2.Department of Ophthalmology,China-Japan Union Hospital of JilinUniversity,Changchun130033,China)

ObjectiveTo understand the mechanism of corneal ulceration,we investigated the role of neutrophil elastase(NE),interleukin-1α(IL-1α)and corneal fibroblasts on expression of the matrix metalloproteinases(MMP)-2,9 in cultured human corneal fibroblasts.MethodsNE or IL-1αwas added to the culture medium of human corneal fibroblasts 5 day later.The activity of MMP-2 and MMP-9were examinedby Gelatin zymography.ResultsCulturedhuman cornealfibroblasts releasedMMP-2 without any stimulation.IL-1αenhanced and activated the expression of MMP-2,while induced the release of proMMP-9.NE transformed proMMP-9into active forms induced by IL-1α.ConclusionNE and IL-1α can promote human corneal fibroblasts in collagen degradation,the two are synergistic.

neutrophil elastase;interleukin-1α;human corneal fibroblasts;MMP-2;MMP-9

R772.21

A

1007-4287(2010)06-0855-03

国家自然科学基金资助项目(30772384)

*通讯作者

2009-05-20)