变形链球菌耐氟菌株的体外诱导

赵洪岩,张志民,朱来宽,李 荟

(1.吉林大学第二医院,吉林长春 130041;2.吉林大学口腔医院)

变形链球菌耐氟菌株的体外诱导

赵洪岩1,张志民2*,朱来宽2,李 荟2

(1.吉林大学第二医院,吉林长春 130041;2.吉林大学口腔医院)

目的体外诱导变形链球菌耐氟菌株。方法在含有不同氟化钠浓度的BHI上逐步诱导变形链球菌产生耐氟菌株,并与亲代菌株进行比较。结果变形链球菌耐氟菌株在体外诱导成功。结论变形链球菌耐氟菌株体外的成功诱导,为耐氟菌株的后续研究奠定了基础。

变形链球菌;氟化物;耐氟菌株

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1095)

为探讨变形链球菌耐氟菌株突变后其致龋毒力的变化,我们通过体外诱导产生变形链球菌耐氟突变株,并观察其生理特征的变化。

1 材料和方法

1.1 材料

(1)细菌:本实验所用细菌为S.mutansUA159;(2)培养基:用于细菌常规培养增菌的培养基为脑心浸液培养基(Brian Heart Infusion;BHI);口腔链球菌选择性培养基为轻唾琼脂培养基(MS)。

1.2 方法

1.2.1 细菌的复苏、培养与鉴定 将40℃牛奶冻干保存的S.mutansUA159取出,用BHI液体培养基溶解后,吸取菌液50 μ L分别接种于BHI液体培养基和固体培养基中,37℃厌氧培养(95%N2,5%CO2)24 h,对固体培养基观察菌落形态同时革兰染色镜检及生化鉴定为变形链球菌后,挑取菌落接种于MS培养基中纯分,37℃厌氧培养(95%N2,5%CO2)24 h,再次革兰染色镜检及生化鉴定。

1.2.2 变形链球菌耐氟菌株的诱导 挑取鉴定为变形链球菌纯培养的单个典型菌落,接种于含有50 μ g/ml NaF的 BHI固体培养基中 37℃厌氧培养(95%N2,5%CO2)24 h,观察菌落形态并进行革兰染色镜检,确定为纯培养后,挑取单个典型菌落接种于含有100 μ g/ml NaF的BHI固体培养基中 37℃厌氧培养(95%N2,5%CO2)24 h,观察菌落形态并进行革兰染色镜检,确定为纯培养后,挑取单个典型菌落接种于含有150 μ g/ml NaF的 BHI固体培养基中37℃厌氧培养(95%N2,5%CO2)24 h,如此反复 ,以50 μ g/ml NaF递增直至在含有1 000 μ g/ml NaF的 BHI固体培养基中获得耐氟菌落,产生 UA159突变株UA159-FR,在不含NaF的BHI固定培养基中连续传代培养20次(每次传代前均进行革兰染色以确定为纯培养),挑取单个典型菌落接种于含有1 000μ g/ml NaF的BHI固体培养基中培养依然生长,进行革兰染色及生化鉴定,UA159-FR在含有1 000 μ g/ml NaF的BHI固体培养基传代培养三次后,对培养至18-24 h的UA159-FR进行菌种保存,即超净台内用无菌滴管吸取无菌牛奶至培养皿中,反复刮取菌落,移至无菌EP管中,每管4-5滴,置于-40℃冰冻后,再置于真空抽干机中抽干成粉末状,封口膜封口后,于-40℃保存。

2 结果

2.1 UA159与UA159-FR在BHI平板上的形态如图1和图2所示 UA159-FR的菌落形态与UA159相似,但较亲代株小。

2.2 UA159与UA159-FR显微镜下形态如图3和4所示 UA159-FR镜下形态体积与UA159相似,但体积增大。

2.3 UA159与UA159-FR生化特征比较 见表1。

图1 UA159在 BHI平板上的形态

图2 UA159-FR在BHI平板上的形态

图3 UA159镜下形态(100倍油镜)

图4 UA159-FR镜下形态(100倍油镜)

表1 UA159与UA159-FR生化特征比较

3 讨论

氟化物是目前使用最广泛的防龋制剂,其对致龋菌的作用是氟防龋的重要机制之一。近年来,为提高并维持菌斑内较高的氟水平,局部应用氟化物的浓度增加,间隔时间缩短,最可能的后果是耐氟菌株的产生。对氟离子敏感的变形链球菌在长期接触氟后可以产生突变或适应性改变,甚至可以导致耐氟菌株的产生。盛江筠[1]发现变链菌耐氟菌株基因型发生改变,且可能包括多个基因的突变,但对于基因突变的具体部位还不清楚。国内外研究均显示,变形链球菌耐氟突变后,其产酸能力和耐酸能力都增强。目前已分离并克隆了多个与变形链球菌耐酸性相关的基因,运用分子生物学技术来探索耐氟菌株相应的耐酸相关基因是否发生突变,并进一步研究其功能,为龋病预防提供相应的理论依据。我们对变形链球菌耐氟菌株的耐酸相关基因进行PCR扩增测序后发现ffh、dgk发生了突变[2,3],这可能与耐氟菌株耐酸性增强有关。

耐氟菌株不仅能降低局部用氟产生的抑龋效果,而且较亲代菌株更不易被氟化物抑制。耐氟菌株的出现,为氟化物防龋提出了新的问题。研究耐氟菌株,可以前瞻性地了解变形链球菌耐氟突变后致龋毒力的变化,为临床上合理应用氟化物及寻找新的防龋药物提供有力的实验依据。为研究耐氟菌株的生物学特性,国内外学者多采用体外诱导方法,获得耐氟菌株。本实验也是在含有不同氟浓度的BHI培养基上逐步诱导变形链球菌(S.mutansUA159),经反复传代培养,最终在氟化钠浓度为1 000 μ g/ml的 BHI培养基中获得了耐氟菌株UA159-FR。所获得的耐氟菌株经反复传代培养20次,仍可在氟化钠浓度为1 000 μ g/ml的BHI培养基中生长。所获得的耐氟菌株UA159-FR最后经过观察平板上的菌落形态、显微镜下菌体形态检测以及一系列的生理生化鉴定即同甘露醇、山梨醇、棉子糖、蜜二糖、七叶苷及精氨酸的反应发现耐氟菌株与其亲代菌株的这些生理生化特征相似,表明我们成功地获得了变形链球菌耐氟菌株,从而为以后对其致龋特性及致龋机制的研究奠定了基础。

[1]盛江筠,刘 正.变形链球菌和远缘链球菌耐氟菌株D N A G+C含量测定[J].上海口腔医学,2001,10(1):49.

[2]张志民,赵洪岩,张家颖.变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因ffh突变的检测[J].现代口腔医学杂志,2007,21(6):570.

[3]张志民,任宝华,张家颖,等.变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因dfk突变的检测及临床意义[J].吉林大学学报(医学版),2008,34(5):850.

Induction of fluoride-resistant strain of streptococcus mutans in vitro

ZHAO Hong-yan1,ZHANGZhi-min2*,ZHU Lai-kuan2,et al.(1.The Second Hospital of Jilin University,Changchun130041,China;2.School of Stomatology,Jilin University,Changchun130021,China)

ObjectiveTo induce fluoride-resistant strain of streptococcus mutans in vitro.Methodsfluoride-resistant strain of streptococcus mutans was obtained by subculturing streptococcus mutans to BHI containing different concentrations of NaF,and they were compared.ResultsInduction of fluoride-resistant strain of streptococcus mutans in vitro is successful.Conclusionfluoride-resistant strain of streptococcus mutans has been induced in vitro,which establishes the foundation for the study of fluoride-resistant strain of streptococcus mutans.

streptococcus mutans;protein expression profile;shotgun

R780.2

A

1007-4287(2010)07-1095-02

*通讯作者

赵洪岩(1973-),男,讲师,在读博士。研究方向:龋病微生物学。

2009-01-25)