系统性红斑狼疮患者IRF5基因表达的研究

张 旋,刘居新,李化会,陈华波,原江水,殷晓婕

(1.山东省青岛卫生学校,山东 青岛 266000;2.青岛市市立医院 检验科,山东 青岛 266011)

系统性红斑狼疮患者IRF5基因表达的研究

张 旋1,刘居新2*,李化会2,陈华波2,原江水2,殷晓婕2

(1.山东省青岛卫生学校,山东 青岛 266000;2.青岛市市立医院 检验科,山东 青岛 266011)

目的探讨SLE人群和正常对照干扰素调节因子5(IRF5)基因表达的差异。方法收集92例活动期的SLE病例与88名正常对照,提取外周血总RNA并反转录为cDNA,采用实时荧光定量聚合酶链反应扩增IR F5基因,获得扩增体系的Ct值后,用公式2-⊿⊿Ct计算SLE组和正常对照组的IRF5的mRNA表达水平。SLE患者抗ds-DNA抗体检测采用免疫印迹法。结果利用实时荧光定量聚合酶链反应扩增得到了预期大小的IRF5基因片段;SLE组、正常对照组外周血IRF5mRNA的表达水平分别为0.232±0.076、0.081±0.040,SLE组IRF mRNA表达水平升高(P＜0.05)。SLE患者抗ds-DNA抗体阳性组IRF5基因表达水平有增高的趋势,但与阴性组相比没有差异。结论系统性红斑狼疮SLE患者外周血IRF5表达异常,可能在系统性红斑狼疮组发病中起一定作用。

系统性红斑狼疮;IRF5;聚合酶链反应

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1082)

系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种以自身抗体产生和免疫复合物形成为特点的自身免疫性疾病[1]。干扰素调节因子家族是能对干扰素的基因表达进行调控的一类转录因子,通过调控淋巴细胞分化、平衡过程,参与炎症反应、细胞周期和细胞凋亡等生物学过程,在自身免疫性疾病发病中起一定作用[2]。目前已知干扰素调节因子5(interferon regulation factor,IRF5)不仅可以诱导产生干扰素,并且通过Toll样受体通路激活干扰素下游靶基因,在自身免疫性疾病发病中起重要的作用[3]。本文对SLE患者外周血IRF5的表达进行研究,初步探讨IRF5在SLE发病机制中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 92例SLE患者来自2005年4月至2006年12月青岛市市立医院、青大医学院附属医院门诊及住院的活动期患者,符合1997年美国风湿病学会SLE诊断标准中的4项或4项以上,其中男性11例,女性81例,年龄13岁-78岁,平均38.2岁;正常对照88例,系我院健康体检者,排除1型糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等疾病,其中男性9例,女性79例,年龄 18岁 -62岁,平均36.5岁。所有研究对象均为无亲缘关系的汉族人。

1.1.2 仪器和试剂 总RNA抽提试剂Trizol(美国Invitrogen公司);逆转录试剂盒 (日本TOYOBO公司);dNTPs、Taq酶(美国MBI公司);扩增引物由上海生工生物工程技术公司合成;LightCyclerTM荧光PCR仪 (瑞士Roche公司)等。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取 按说明书操作,最后用DEPC水溶解RNA,-70℃冻存。

1.2.2 cDNA的合成 DEPC水 6 μ l,5×缓冲液 4 μ l,dNTPs 2μ l,RNase inhibitor 1 μ l,随 机 引物 1 μ l,RNA 5 μ l,逆转录酶 1 μ l。反应条件 :30℃30 min,42℃20 min,99℃5 min,4℃5 min。

1.2.3 荧光定量PCR扩增 GAPDH作为内参。目的基因和GAPDH分别在不同的毛细管中进行扩增。反应体系为:5×Buffer 2 μ l,dNTPs 0.4 μ l,引物0.4 μ l,Taq 酶 1.0 μ l,BSA 1.0 μ l,SYBR Green I 1.0 μ l,cDNA模板 1.0 μ l,MgCl23.2 μ l,三蒸水补至 20 μ l。 95 ℃ 7 min预变性,95℃7 s变性,其余按表1进行扩增。

表1 引物序列、PCR退火温度和检测温度

分析扩增体系的Ct(Cycle threshold)值。Ct值是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Ct值越大,参与反应的起始模板量就越少;反之则越多。计算-Δ Δ Ct值,其值越大,起始模板量就越多。 -Δ Δ Ct值=-(样本原始Ct值-样本GAPDH的Ct值)。计算IRF5mRNA的表达量,计算公式[4]:2-ΔΔCt。

1.2.4 抗ds-DNA抗体检测 SLE病人抗ds-DNA抗体采用免疫印迹法常规检测。

1.3 统计学处理

采用SPSS12.0统计软件进行分析,-Δ Δ Ct值的比较采用t检验,以P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 目的基因扩增产物电泳结果 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,显示IRF5片段长度在预期的范围内,见图 1。

图1 IRF5扩增产物电泳结果

2.2 IRF5 mRNA定量表达 SLE患者外周血IRF5 mRNA表达是 0.232±0.076,对照组为 0.081±0.040,两组相比表达水平有统计学差异(P＜0.05)。

2.3 IRF5mRNA表达量与抗ds-DNA抗体的关系92例SLE患者中,检出抗ds-DNA抗体51例,阳性率为55.43%。阳性组和阴性组IRF5mRNA表达水平分别为0.240±0.083、0.221±0.075,两组比较表达水平没有统计学差异(p＜0.05)。

3 讨论

SLE是以多克隆B细胞高度增生活化和多种自身抗体生成为特点的自身免疫病。但近年来发现I型干扰素系统在SLE病因发病机制中起一定作用:动物实验表明IFN-1活化后引起SLE鼠自身抗体滴度升高,而在IFN-1受体纯合子缺陷的SLE鼠引起的损伤明显减轻,也发现在SLE的发病中诱导干扰素表达的基因呈高表达状态[5]。干扰素调节因子是一类主要调节干扰素表达的转录因子,能够与干扰素基因的顺式元件结合,调节干扰素基因的转录,目前已知的家族成员有IRF1-IRF10[6]。这些都表明IRF5在SLE患者发病中起一定作用。

本文采用荧光定量PCR方法检测SLE患者外周血IRF5mRNA表达情况。结果发现SLE患者外周血IRF5mRNA表达水平为0.232±0.076,比对照组高(P＜0.05)。国内尚未有IRF5与SLE相关性的研究,我们的结果与国外报道相符[7]。

由IRF5介导诱导IFN-α、IFN-β及一些细胞因子(IL-6、TNF等)表达,激活IFN下游靶基因。IRF5表达增高后,从而激活特异性的获得性免疫,诱导产生自身抗体,引起病理损伤。

IRF5还参与了细胞凋亡过程[6]。IRF5信号转导途径的下游蛋白质包括Bax、胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-3和Fas结合死亡域蛋白质/胱天蛋白酶-8,活化的IRF5激活胱天蛋白酶级联反应,使线粒体释放细胞色素C,改变线粒体膜电位,改变细胞膜的对称结构,导致DNA断裂和细胞凋亡。

我们将SLE患者IRF5mRNA表达水平与抗ds-DNA抗体结果进行比较发现,抗ds-DNA抗体阳性组和阴性组中,IRF5mRNA表达水平没有差异。但是我们发现抗ds-DNA抗体阳性组中,IRF5mRNA表达水平有增高的趋势。我们推测IRF5基因表达增高,加重了机体的损伤。

综上所述高表达的IRF5在SLE的发病中起一定作用,但是应进一步加大研究IRF5与SLE的相关性,以明确IRF5的作用,期待为SLE的预防、诊断和治疗提供帮助。

[1]Rahman AH,Eisenberg RA.The role of toll-like receptors in systemic lupus erythematosus[J].Springer Semin Immunopathol,2006,28(2):131.

[2]陈 静,谭志建,涂亚庭,等.银屑病患者皮损中浆细胞样树突细胞和Toll样受体9、干扰素调节因子7及干扰素αmRNA的表达[J].中华皮肤科杂志,2007,40(11):702.

[3]Rueda B,Reddy MV,González-Gay MA,et al.Analysis of IRF5 gene functional polymorphisms in rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum,2006,54(12):3815.

[4]Rasmussen R.Quantification on the Light Cycler.Rapid Cycle Real-time PCR,Methods and Applications[M].Springer Press,Heidelberg,2001:21.

[5]Santiago-Raber ML,Baccala R,HaraldssonKM,et al.Theofilopoulos AN:Type-I interferon receptor deficiency reduces lupus-like disease in NZB mice[J].J Exp Med,2003,197(6):777.

[6]Baechler EC,Gregersen PK,Behrens TW.The emerging role of interferon in human systemic lupus erythematosus[J].Current Opinion in Immunology,2004,16(6):801.

[7]Graham RR,Kyogoku C,Sigurdsson S,et al.Three functional variants of IFN regulatory factor 5(IRF5)define risk and protective haplotypes for human lupus[J].PNAS,2007,104(16):6758.

The Expression of IRF5 Gene in SLE Patients

ZHANG Xuan,LIU Ju-xin,LI Hua-hui,et al.(Department of Laboratory Medicine,Qingdao Municipal Hospital,Qingdao266011,China)

ObjectiveTo investigate whether the expression of IRF5 is abnormal in systemic lupus erythematosus patients.MethodsThe clinical data of 92 systemic lupus erythematosus patients and 88 normal controls were collected.Peripheral blood was drawn from every subjectinthe morning.The total RNA of peripheralbloodwas extracted and transcripted to cDNA.SYBR greenI real-time quantitative polymerase chain reactionwas used to amplify IRF5 gene.Ct of every subjectwas obtainedfrom real-time quantitative polymerase chain reaction system.The mRNA expression was indicated as the value of 2-⊿⊿Ct.IRF5mRNA expression in systemic lupus erythematosus patients and normal controlswas compared.ds-DNA antibody was detected by immunoblotting method.ResultsThe expected fragments of IRF5 gene were amplified by real-time quantitative polymerase chain reaction.The levels of IRF5 mRNA insystemic lupus erythematosus patients and normal controlswere 0.232±0.07 and 0.081±0.040 respectively(P＜0.05).The levels of IRF5 mR NA in SLE ds-DNA antibody positive group tend to rise,but the difference in ds-DNA antibody positive and negative groupwas not significant.ConclusionAbnormal IRF5 mRNA expression is found in the peripheral blood of systemic lupus erythematosus patients.IRF5 may play roles in the pathogenesis of systemic lupus erythematosus.

systemic lupus erythematosus IRF5 PCR

R593.24+1

A

1007-4287(2010)07-1082-03

青岛市科技局,合同编号05-1-NS-77

*通讯作者

2008-11-24)