血清survivin抗体及mRNA含量检测对肺癌诊断价值研究

刘乃政,王纪敏,司 磊,田小侠

(聊城市人民医院,山东 聊城 252000)

血清survivin抗体及mRNA含量检测对肺癌诊断价值研究

刘乃政,王纪敏,司 磊*,田小侠

(聊城市人民医院,山东 聊城 252000)

目的探讨血清survivin基因表达及抗体对肺癌诊断价值。方法收集47例患有不同类型的肺癌患者外周血标本,及作为对照控制的30例健康体检者。分别采用ELISA检测血清中survivin抗体水平和逆转录PCR检测肺癌患者血清中survivin mRNA表达水平的测定,对各组数据统计分析两种指标相关性及其诊断价值。结果肺癌病人血清血清survivin抗体表达与血清survivin-mRNA的表达均高于正常对照组(P＜0.05),二者呈正相关(P＜0.01,Pearson'sR=0.367)。结论血清survivin-mRNA及抗体检测是临床肺癌诊疗中价值较大的临床指标。

肺癌;survivin;survivin抗体

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1042)

虽然survivin对于肺癌不具有组织特异性,但有着肿瘤特异性,因此检测肺癌患者survivin表达,可以明确肿瘤有无转移,对手术选择术式及清扫范围,确定术前、术后治疗方案,减少肿瘤的转移和复发将起到重要作用,从而为临床的诊断、治疗带来根本变化。ELISA法检测抗-survivin抗体和逆转录PCR检测肺癌患者血清中survivin-mRNA表达水平,具有快速、无创伤、取材方便、定量准确、可大量检测等优点。通过测定血清中survivin基因抗体和肺癌患者血清中survivin mRNA表达水平,进一步深入探讨血survivin抗体检测在肺癌诊断中的价值。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集聊城市人民医院2008年4月-2009年5月经病理证实的肺癌患者外周血标本共47例(每管2 ml,促凝胶促凝)。作为对照控制的健康体检者外周血标本30例。患者包括鳞癌、腺癌、小细胞肺癌和大细胞癌。标本分别由聊城市人民医院肿瘤科门诊及健康查体中心提供。

1.2 主要试剂

survivin抗体试剂盒购自美国Assay Designs公司。TRIzol kit(Invitrogen)、oligo-(dT)15(Takara D510)、Ribonuclease Inhibitor(Takara D2310A)、M-MLV Reverse Transcriptase(Promega M170A)、Takara Taq DNA Polymerase(Takara DR100AM)、DNA MarkerⅠ(天根生化MD101)。其余生化试剂都为进口分析纯试剂。

1.3 实验仪器

BIO-680酶标仪。博日基因扩增仪(型号TCXP)、AvantiTMJ-30I高速低温离心机(Backman-Coulter公司)、DYY-7C型电泳仪(北京六一仪器厂)、DYCP-31D型水平式电泳槽(北京六一仪器厂)、紫外分析仪(北京宾达英创科技有限公司)。

1.4 试验方法

1.4.1 ELISA法按照试剂盒说明书操作步骤进行。

1.4.2 RT-PCR实验 常规提取血总RNA,分光光度法测定RNA的浓度和纯度,1%琼脂糖电泳鉴定RNA的完整性。以2μ g总 RNA为逆转录模板,以Oligo(dT)12为引物,在M-MLV逆转录酶作用下合成单链cDNA。引物:survivin-S 5'-cca ctg ccc cac tga gaa c-3';survivin-A 5'-acc gga cga atg ctt ttt atg-3'。

1.5 统计学处理

应用SPSS软件对所获得的数据进行统计分析,其中率的比较采用 χ2检验,分析血清survivin抗体表达与血清survivin-mRNA的关系采用双向有序列联表资料的χ2检验。

2 结果

2.1 血清survivin抗体检测 见表1。

表1 不同标本血清survivin抗体浓度

2.2 血清survivin-mRNA灰度分析 琼脂糖凝胶电泳结果表明(图1),8组泳道中细胞内源actin基因片段条带的亮度强弱相似,说明RT-PCR中加入模板的量一致,而扩增的survivin基因电泳带存在明显差异。肺癌患者血清survivin-mRNA的表达情况见图2。survivin-mRNA在47例肺癌患者血清的阳性为5例,阳性率10.6%(5/47),30例对照组中survivin-mRNA全部为阴性,表达率为0%(0/34),两者比较有统计学差异(P＜0.05)。

图1 RT-PCR结果灰度分析图

图2 不同标本survivn/actin灰度比分布图

2.3 统计学分析 通过分析肺癌病人血清血清survivin抗体表达与血清survivin-mRNA的关系:肺癌病人血清survivin抗体表达与血清survivin-mRNA的表达呈正相关(P=0.001,Pearson's R=0.367)。

3 讨论

研究表明,survivin的组织分布具有明显的细胞选择性-肿瘤特异性,并且在细胞中的表达具有严格的细胞周期依赖性-G2/M期特异性表达[1,2]。ELISA试验表明30份健康血清中抗survivin抗体均低于临界值;47份肺癌患者血清中抗survivin抗体阳性率为17.0%(8/47)。两者比较有统计学差异(P＜0.05)。结果与Jacques Rohayem等[3]的研究结果一致。

通过对47例肺癌患者血清survivin-mRNA检测,其中外周血survivin-mRNA阳性表达率为10.6%(5/47),30例对照组中survivin-mRNA全部为阴性,表达率为0%(0/34),两者比较有统计学差异(P＜0.05)。由于外周血循环系统中存在RNA酶,因此,进入循环系统中的游离mRNA分子迅速被降解而不能被检测到,所有在外周血中检测到的mRNA表达一定是存在于细胞内的mRNA分子。通过分析肺癌病人血清血清survivin抗体表达与血清survivin-mRNA的关系:肺癌病人血清血清survivin抗体表达与血清survivin-mRNA的表达呈正相关(P=0.001,Pearson'sR=0.367)。这可能由于外周血循环系统中存在RNA酶,进入循环系统中的游离mRNA分子迅速被降解而不能被检测到,所有在外周血中检测到的mRNA表达一定是存在于细胞内的mRNA分子。因为survivin基因仅在肿瘤细胞中特异表达,说明血循环中有微量肺癌肿瘤细胞存在。实验数据表明具有抗原性的survivin蛋白可表达于外周血中,因此检测外周血中的抗-survivin抗体不失为诊断肺癌的一种理想的方法。survivin蛋白在多数肺癌中过表达,而且在肺癌的不同阶段它的细胞内定位不同[4],随着肿瘤的发展在血清中也可检测出其相关物质的存在,因而可以把对于survivin的相关检测看作为肺癌早期诊断、治疗和判定预后的一个重要的生物标志物。

[1]Tanaka T,Delong PA,Amin K,et al.Treatment of lung cancerusing clinically relevant oral doses of the cyclooxygenase-2 in-hibitor rofecoxib potential value as adjuvant therapy after surgery[J].AnnSurg,2005,241(1):168.

[2]惠文涛,南克俊.凋亡抑制蛋白survivin的研究进展[J].第四军医大学学报,2005,26(19):1811.

[3]Rohayem J,Diestelkoetter P,Weigle B,etal.Antibody respone tothe tumor-associated inhibitor of apoptosis protein survivin in can-cer patients[J].Cancer Res,2000,60(7):1815.

[4]Ying-bei Chen,Jean Kao,Xi K Zhou,et al.Survivin as a useful adjunct marker for the grading of papillary urothelial carcinoma[J].Arch Pathol LabMed,2008,2(132):224.

Diagnostic value of serum survivin-antibody and survivin-mRNA in lung cancer

LIUNai-zheng,WANGJi-min,SI Lei,et al.(Liaocheng People's Hospital,Liaocheng252000,China)

ObjectiveAim To study the diagnostical value on anti-surviving antibodies serum of lung cancer.MethodsSerum levels of anti-survivin antibodies and survivin-mRNA in 47 patients with lung cancer and serum levels 30 healthy subjectswere measured by ELISA method and RT-PCR.ResultsThe serum levels of anti-survivin antibodies and the survivin-mRNA were higher than the normal group(P＜0.05),and the antibodies level was related to the survivin-mR NA(P＜0.01,Pearson'sR=0.367).ConclusionSurvivin-mRNA and anti-survivin-antibodies detection may be identified as an attractive novel marker for the diagnosis of lung cancer.

Lung-cancer;Survivin;Survivin-antibody

R734.2

A

1007-4287(2010)07-1042-02

*通讯作者

2009-01-13)