胶质细胞源性神经营养因子基因转染雪旺氏细胞的实验研究

杜文彦,王景宏,刘钦毅,郑长军*

(1.佳木斯大学附属第一医院 骨科,黑龙江 佳木斯 154002;2.吉林大学第二医院 骨科,吉林 长春 130041)

胶质细胞源性神经营养因子基因转染雪旺氏细胞的实验研究

杜文彦1,王景宏1,刘钦毅2,郑长军2*

(1.佳木斯大学附属第一医院 骨科,黑龙江 佳木斯 154002;2.吉林大学第二医院 骨科,吉林 长春 130041)

目的应用胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因转染雪旺氏细胞,观察GDNF基因在雪旺氏细胞内的表达效果,以及对雪旺氏细胞的营养作用。方法将雪旺氏细胞分为空白对照组、载体组、空载体组,通过阳离子脂质体介导,将GDNF基因转染雪旺氏细胞。用细胞增殖实验(MTT)、免疫组化、流式细胞仪观察在 24 h、48 h、72 h各组转染后对细胞的营养作用。结果在载体组细胞的生长状况较其他两组增殖良好。免疫组化可见GDNF在载体组细胞内呈现高表达。流式细胞仪观察基因转染后对雪旺氏细胞有明显的营养作用。结论GDNF基因转染雪旺氏细胞后,在细胞内呈现高表达,并对细胞有明显的营养作用。

雪旺氏细胞;胶质神经源性神经营养因子(GDNF)基因;转染

Q785

A

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0020)

脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)是一种严重的神经系统创伤性疾病,神经损伤后可导致神经元死亡、局部瘢痕形成等一系列病理变化。神胶质细胞源性神经营养因子及雪旺氏细胞对神经损伤后的修复起到重要作用,但是二者单独应用于神经损伤的修复治疗有其局限性,我们将胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因导入雪旺氏细胞,观察GDNF的表达和对细胞的营养作用。

1 材料和方法

1.1 材料

雪旺氏细胞(吉林大学口腔医学院生物工程实验室提供)。倒置显微镜(OLYMPUS公司);离心机(长沙湘仪公司);流式细胞仪(BD公司);高速冷冻离心机(Eppendorf公司);-80℃冰箱(三洋公司)。MTT(Sigma公司);DMEM(GIBCO公司);GDNF抗体(ADL公司);SP免疫组化试剂盒(福州迈新公司);LipofectamineTM脂质体转染试剂盒(Gibco公司)

1.2 方法

1.2.1 实验分组 将构建的重组质粒pEGFP-N1/GDNF和质粒pEGFP-N1分别通过脂质体转染法导入纯化培养的雪旺细胞,同时设立空白对照组,以观察SCs的GDNF的表达情况。其中空白对照组:不做转染的SCs;空载体组:将质粒pEGFP-N1转染导入SCs;实验组:将重组质粒pEGFP-N1/GDNF转染SCs。

1.2.2 质粒的制备 将携带实验组和空载体组的质粒接种在含有选择抗菌素的平皿上,培养成功后,在两组分别取出100 U至20 ml的LB液体培养基中,在37℃过夜震荡培养16-18小时。将培养好的菌液收集于离心管内,于4℃5 000 rpm离心15 min,弃上清。加0.1倍体积3 M醋酸钠(pH4.6)混匀后冰浴静止放置30 min以上。于4℃4 000 rpm离心15 min,弃上清。加无DNA酶的RNA酶(10 mg/ml)于上清液中,在37℃下培养30min。加等体积的酚:氯仿:异丙醇(25∶24∶1)混合液摇匀,于 4℃5 000 rpm离心10 min,加等体积95%乙醇,-20℃下放置30 min,于20℃5 000 rpm离心10 min,弃上清。加入等体积13%聚乙二醇溶液8 000(1.6 M/NaCl),在4℃下静置过夜。离心10 min,4℃下10 000 rpm,弃上清。用70%冷乙醇洗涤并抽干,于-80℃储存备用。

1.2.3 雪旺细胞的培养 从液氮罐中取出冻存管中的SC,放入37℃恒温水箱迅速复温,并不断摇动,使之迅速融化,待融化后,转移至75 ml培养瓶内,800 r/min离心5 min,弃上清。加入含10%高糖DMEM培养基至5 ml,在37℃,含 5%CO2的饱和湿度的CO2细胞培养箱中培养24 h,更换新鲜培养液。待贴壁细胞达80%-90%左右时采用胰酶消化法按1∶4传代,观察细胞生长状态良好时,准备转染。

1.2.4 细胞的转染 取对数生长期的细胞,胰酶消化,调细胞浓度为2×105,分别接种于6孔培养板,每孔2 ml。置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁,培养6-24小时。观察细胞密度达80%时,进行下列操作。取一Ep管,空载体组与载体组分别取5 μ g质粒,加无血清、无抗生素培养基至97 μ l,空白对照组直接加无血清、无抗生素培养基至 97 μ l,取 3 μ l脂质体加入到上述混合液中。振荡混匀或漩涡混匀2 s,室温孵育15 min。用无血清、无抗生素培养基洗细胞2次,加无血清、无抗生素培养基,将上述混合液加至培养液表面,充分混匀,注意不能溅到培养板盖上。8小时后,更换完全培养基。72小时后荧光显微镜检测

1.3 观察指标

倒置显微镜下观察细胞的转染效果;用MTT方法检测转染后细胞的生长情况;用免疫组化观察转然后的雪旺氏细胞中的GDNF表达情况;用流式细胞仪检测转染后细胞的细胞周期,观察细胞增殖情况。

1.4 统计学处理

全部数据采用Excel软件包进行统计分析和处理,每两组数据间比较采用t检验。

2 结果

2.1 倒置显微镜下观察转染细胞效果

转染24 h后开始行倒置荧光显微镜观察绿色荧光表达强度。转染24 h后,可见空白对照组未见荧光细胞表达。空载体组和载体组雪旺细胞在荧光显微镜下发出绿色荧光。至培养72 h,高倍显微镜下可见空载体组和载体组绿色荧光亮度增强(图1),表明细胞转染效果较好。

图1 倒置显微镜下质粒转染SCs细胞的荧光表达

2.2 MTT检测结果

在用MTT方法检测三组(空白对照组、空载体组、载体组)细胞24小时、48小时、72小时的生长状况显示:24小时时细胞生长状况无明显的变化,48小时空载体组细胞数减少,这说明单纯的脂质体转染对细胞有一定的毒性作用。在72小时载体组的细胞数量与空白对照组及空载体组比较有明显差异(P＜0.01)。说明GDNF转染雪旺氏细胞对细胞有明显的营养作用,见表1。

2.3 免疫组化检测结果

免疫组化染色72小时后镜下观察显示:空白对照组和空载体组SCs胞浆内有浅棕色免疫复合物沉积,而载体组的SCs中胞浆内有深棕色免疫复合物沉积(图2),表明GDNF基因在SCs中成功表达,且载体组GDNF的表达较空白对照组和空载体明显增多。

2.4 流式细胞仪检测结果

在用流式细胞仪方法检测三组(空白对照组、空载体组、载体组)细胞24小时、48小时、72小时的 S期细胞增殖情况见表2。

表1 不同时间各组细胞增殖实验检测结果

图2 镜下质粒转染SCs细胞的免疫组化图

表2 不同时间各组流式细胞仪检测结果

3 讨论

胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)是由1993年Lin等[1]首先发现的蛋白质因子,是从大鼠胶质细胞系B49的无血清培养基中经浓缩、分离纯化出来的。初期研究发现GDNF对中脑的多巴胺能神经元有较高的营养作用,随着研究的深入发现GDNF家族成员对运动神经元具有营养作用。可以阻止体内运动神经元退变,对脊髓运动神经元起保护作用[2]。通过实验研究表明,GDNF是现阶段神经营养因子中作用最强的[3-5]。GDNF基因已经广泛的应用于神经损伤后的修复的基础实验中。实验证明了由于脑脊屏障的存在,单纯的GDNF治疗受到明显限制。

雪旺氏细胞(Schwann cells,SCs)可以分泌多种神经营养因子,在周围神经损伤后的修复中具有重要作用。虽然雪旺氏细胞对神经损伤的修复有较强的营养作用,但是单纯雪旺氏细胞移植治疗很难穿越星形胶质细胞形成的瘢痕区域。这是由于单纯SC移植神经营养因子分泌量不足、且分泌具有时效局限性及在损伤脊髓的胶质瘢痕中存活不良所致,因此单纯SC移植治疗神经损伤很难达到理想的效果。

在我们的实验中,我们通过阳离子脂质体介导,将胶质细胞源性神经营养因子基因转入雪旺氏细胞中,形成基因修饰的雪旺氏细胞,观察基因在雪旺氏细胞中的表达效果以及神经营养因子对雪旺氏细胞的营养作用。实验结果表明,通过阳离子脂质体将重组质粒pEGFP-N1/GDNF转入雪旺氏细胞中,能够高效表达胶质细胞神经营养因子,表达的神经营养因子对雪旺氏细胞具有明显的营养作用,对进一步应用基因修饰的雪旺氏细胞移植治疗脊髓损伤打下坚实的基础。相信随着相关研究的深入,脊髓损伤治疗的效果能够得到进一步提高。

[1]Lin LF,Doherty DH,Lile JD,et al.GDNF:a glial cell line derived neurotrophic factor for midbrain dopaminerigic neurons[J].Science,1993,260(5111):1130.

[2]Milbrandt J,Desauvage FJ,Fahrner TJ,et al.Persephin,a Novel Neurotrophic Factor Related to GDNF and Neurtuin[J].Neuron,1998,20:245.

[3]Kasahara K,Nakagawa T,Kubota T.Neuronal loss and expression of neurotrophic factors in a model of rat chronic compressive spinal cord injury[J].Spine,2006,1531(18):2059.

[4]Lim PA,Tow AM.Recovery and regeneration after spinal cord injury:a review and summary of recent literature.Ann Acad Med Singapore[J].2007,36(1):49.

[5]Macias MY,Syring MB,Pizzi MA,et al.Pain with no gain:allodynia following neural stem cell transplantation in spinal cord injury[J].Exp Neurol,2006,201(2):335.

The Experimental Study of Glial Cell Line-derived Neurotrophic Factor Gene Transfection to Schwann Cells

DU Wen-yan,WANGJing-hong,LIU Qin-yi,et al.(The OrthopedicsDepartment of theFirst Hospitalof JiamusiUniversity,Jiamusi154002,China)

ObjectiveTo observe the expression of GDNF and the role of nutrition and protection in Schwann cells through GDNF gene's transfetion to Schwann cells.MethodsThe Schwann cells were divided into control group,empty vector group,vector group.The GDNF gene was transfected into Schwann cellsthrough cationic liposome mediattion.The nutritional function and expression effectwere examined thoughMTT,immunohistochemistry,flow cytometry at 24 h,48 h,72h after transfection of eachgroup.ResultsThe cells in vector group were more proliferated and vigorous than the other two groups in MTT;Immunohistochemistry showed high expression of GDNF in vector group;There were obvious nutritional role of transfectedGDNF gene on Schwann cells in flow cytometry.ConclusionAfter GDNF gene transfection to Schwann cells,there were high expression of GDNF gene which had obvious nourishing and protective effects on Schwann cells.

Schwann cells;Glial-derived neurotrophic factor;transfection

1007-4287(2010)01-0020-03

吉林省科技厅资助课题,课题编号为200705222

*通讯作者

2009-05-22)