嘌呤核苷酸补偿对海洛因依赖大鼠脑组织中TPH和GTPCH基因表达的影响

李鸿梅,李 坤,何海涛,刘剑凯,洪 敏

(吉林大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室,吉林长春 130021)

嘌呤核苷酸补偿对海洛因依赖大鼠脑组织中TPH和GTPCH基因表达的影响

李鸿梅,李 坤,何海涛,刘剑凯,洪 敏*

(吉林大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室,吉林长春 130021)

目的研究嘌呤核苷酸补偿对海洛因依赖大鼠脑组织中色氨酸羟化酶(tryptophan hydroxylase,TPH)、GTP环水化酶1(GTP cyclohydrolase 1,GTPCH)基因表达的影响。方法剂量递增腹腔注射海洛因,建立海洛因依赖大鼠模型,50只正常雄性Wistar大鼠随机分为对照组(C)、海洛因组(H)、海洛因补偿AMP+GMP组(HAG)、海洛因补偿AMP组(HA)、海洛因补偿GMP组(HG),每组10只。Real-time PCR法测定各组大鼠脑组织中TPH和GTPCH1基因的表达。结果与C组比较,H组大鼠脑组织中TPH基因表达下降71%(P＜0.05);与H组比较,HAG,HA和HG组大鼠脑组织中TPH基因表达分别升高60%,100%和150%(P＜0.05)。与C组比较,H组大鼠脑组织中,GTPCH基因表达下降43%(P＜0.05);与H组比较,HAG,HA和HG组大鼠脑组织中GTPCH基因表达均有所升高,但差异不显著(P＞0.05)。结论海洛因给药使大鼠脑组织中TPH,GTPCH基因表达下调;嘌呤核苷酸补偿可以减弱海洛因对TPH和GTPCH基因表达的影响。

嘌呤核苷酸;海洛因;色氨酸羟化酶;GTP环水化酶

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0026)

急性全身性给予阿片类可以使5-HT的合成增加[1],并使TPH的活性增强[2]。急性给予吗啡可以使前脑广泛区域内5-HT的循环和释放增加[3]。本实验室前期研究发现,长期应用吗啡、海洛因等阿片类物质可引起嘌呤核苷酸分解过度,表现为分解代谢终产物尿酸增加,分解代谢关键酶腺苷脱氨酶(ADA)和黄嘌呤氧化酶(XO)活性增强[4-7]。我们前期的研究结果还表明,长期慢性给予海洛因可以使海洛因依赖大鼠脑组织中5-HT及其代谢产物5-HIAA及TPH的含量都下降;嘌呤单核苷酸补偿能使海洛因依赖大鼠脑组织中5-HT和5-HIAA的含量增加,并能够增加TPH的含量[8]。四氢生物喋呤(BH4)是生物体内羟化酶(如TH,TPH)的重要辅助因子,而BH4是由GTP环水化酶1(GTPCH)以GTP为底物催化合成的,因而GTPCH基因的表达水平必定会影响GTP含量以及羟化酶的表达。本实验中,我们用适时RT-PCR方法分析了海洛因依赖及嘌呤核苷酸补偿大鼠脑组织中TPH和GTPCH基因表达的变化,以探讨海洛因使神经递质5-HT含量下降及嘌呤核苷酸补偿对5-HT含量影响的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 正常雄性Wistar大鼠50只,体重(200±20)g,由吉林大学实验动物中心提供。海洛因(纯度为99%)由吉林省公安厅提供,临用时用灭菌三蒸水溶解。Trizol及适时 RT-PCR试剂盒为TaKaRa公司产品(SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit,Lot BK1301),其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法 50只大鼠随机分为5组,每组10只,普通固体饲料,自由饮水,同条件饲养。①对照组(C):每日2次腹腔注射(ip)生理盐水,注射体积和时间与当天实验组相同,第10天处死。②海洛因给药组(H):第1-9天每日早晚2次注射海洛因,日剂量分别为0.5,0.75,1.25,2.0,3.0,4.25,5.75,7.5,and 7.5mg/kg体重,第10天处死。③海洛因给药补偿AMP+GMP组(HAG):海洛因给药同海洛因组,同时腹腔注射等摩尔混合的AMP+GMP,给药浓度为7.5 mg/kg体重,第10天处死。④海洛因给药补偿AMP组(HA):第1-9天给药时间与剂量同海洛因给药组,同时腹腔注射AMP,给药浓度为7.5 mg/kg体重,第10天处死。⑤海洛因给药补偿GMP组(HG):第1-9天给药时间与剂量同海洛因给药组,同时腹腔注射GMP,给药浓度为7.5 mg/kg体重,第10天处死。各组动物均腹腔注射水合氯醛麻醉,断头后冰上快速取脑,分离中脑后-80℃保存。

1.3 脑组织中TPH、GTPCH基因表达的分析 取液氮中冻存的脑组织100 mg,4℃条件下以Trizol试剂提取总 RNA,定量后反转录成cDNA。Real-Time PCR引物:以Primer 5软件设计大鼠TPH基因、GTPCH基因及β-actin mRNA嵌合荧光Real-Time PCR引物,经检索Blast验证特异性。TPH基因(NM-001100634):上游引物:5-TGGAGACTGTCCCTTGGT-3,下游引物:5-TAGCCAGCTCTGCGAAAT-3,产物长度:153 bp;GTPCH基因(NM-024356):上游引物:5-AGAACGCCTTACCAAACAGA-3,下游引物:5-CCCGAGTCTTTGGGTCTT-3,产物长度 :179 bp;β-actin 基因(NM-031144):上游引物:5-AAGAGAGGCATCCTGACCCT-3;下游引物:5-TACATGGCTGGGGTGTTGAA-3,产物长度:218 bp。适时PCR条件为:95℃,10 s;40 cycles(95℃,5 s,61℃,31 s)。

1.4 统计学方法 数据以比较Ct值法(△△Ct)对基因表达进行分析,所有假设检验以0.05为检验水准。

2 结果

2.1 嘌呤核苷酸补偿对大鼠脑组织中TPH基因表达的影响

如图1所示,与对照组比较,海洛因组大鼠脑组织中TPH基因表达下降71%(P＜0.05);与海洛因组比较,HAG,HA和HG组中TPH基因表达分别升高60%,100%和150%(P＜0.05)。

图1 大鼠脑组织中TPH基因表达

2.2 嘌呤核苷酸补偿对大鼠脑组织中 GTPCH基因表达的影响

如图2所示,与对照组比较,海洛因组大鼠脑组织中GTPCH基因表达下降43%(P＜0.05);与海洛因组比较,HAG,HA和HG组GTPCH基因表达分别升高39%,4%和21%,但差异不显著(P＞0.05)。

图2 大鼠脑组织中GTPCH基因表达

3 讨论

TPH是5-HT合成的限速酶,BH4是色氨酸羟化酶发挥最适催化活性的重要辅助因子。尽管BH4对TPH的确切作用机制还不清楚,但是越来越多的证据表明,BH4是羟化酶重要的变构调节剂及氧化还原反应的辅助因子[9,10,11]。BH4是以GTP为底物,经过一系列酶的催化作用而生成的[8],BH4的水平除了取决于底物GTP含量外,还取决于GTP环水化酶(GTPCH)的活性和该基因表达水平的高低,GTPCH是合成BH4的一系列酶促反应的第一个酶,也是BH4生物合成的限速酶[12,13,14]。我们的研究结果表明,海洛因使大鼠脑组织中GTP含量下降(文章待发表)、TPH基因和GTPCH基因表达下调;GTPCH基因表达下调,很可能会导致BH4生成减少以及TPH催化活性的下降,并最终导致5-HT和5-HIAA含量下降。补偿嘌呤核苷酸后,大鼠脑组织中GTPCH基因表达比海洛因组大鼠高。AMP和GMP在生物体内经过两次激酶的催化和转化后可生成GTPCH的底物GTP。AMP和GMP通过激酶的催化生成GTP,使GTP水平升高(文章待发表),并使GTPCH基因的表达也升高,其机制可能是底物对酶的正反馈调节作用。GTP含量的升高以及GTPCH基因表达水平的升高,可能会使BH4的生成增多以及TPH含量升高、催化活性增强,并最终使5-HT和5-HIAA含量升高。能使脑中5-HT含量升高的药物,如氟西汀和5-羟色氨酸,可以消除慢性吗啡依赖并戒断的大鼠对吗啡相关环境的偏爱,当将氟西汀显微注射到大鼠伏隔核时,也能观察到相似的结果,氟西汀还能改善吗啡戒断大鼠的焦虑状态[15]。这提示嘌呤核苷酸具有治疗阿片成瘾及减轻阿片戒断症状的潜能。

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Effects of purine nucleotides compensation on TPH and GTPCH gene expression in heroin dependent rats

LI Hong-mei,LI Kun,HE Hai-tao,et al.(Department of Biochemistry and Molecular Biology,School of Basic Medical Sciences,Jilin University,Changchun130021,China)

ObjectiveTo investigate the effects of purine nucleotides compensation on the expression of tryptophan hydroxylase(TPH)and GTP cyclohydrolase(GTPCH).MethodsRatswere administered with heroin by intraperitoneal injectionwith increasing dose to develop addiction models.Fifty male Wistar rats were divided into five groups:control group(C),heroin group(H),heroin plus purine mononucleotides(AMP+GMP,equal mole mixture)group(HAG),heroin plus adenosine monophosphate(AMP)group(HA),heroin plus guanosine monophosphate(GMP)group(HG).TPH and GTPCH gene mRNA were analyzed by real-time PCR.ResultsTPH gene expression was decreased by 71%in H group when compared with C group(P＜0.05);in HAG,HA and HG group,TPH gene expressionwasincreased by 60%,100%and150%respectively when comparedwithH group(P＜0.05).GTPCH gene expression was decreased by 43%in H groupwhen compared with C group(P＜0.05);in HAG,HA andHG group,GTPCH gene expression was increasedwith no significant differences(P＞0.05).ConclusionAdministration of heroin can decreased the expression of TPH and GTPCH gene;purine nucleotides compensation can attenuate the effect of heroin on TPH andGTPCH gene expression.

Purine nucleotides;Heroin;TPH;GTPCH

Q786

A

1007-4287(2010)01-0026-03

吉林大学重大重点项目发展启动基金资助项目(No 200602037);吉林省科技发展计划项目(No 20080435-2)

*通讯作者

李鸿梅(1975-),女,博士生,主要从事阿片的作用机制及治疗研究;洪敏(1945-),男,教授,博士生导师,研究方向:阿片的作用机制及治疗。

2009-05-11)