牛磺酸对大鼠肢体骨骼肌缺血再灌注后内质网应激反应的影响

浦践一 ，赵 琪，门秀丽 #，张艳敏，张连元

（1.华北煤炭医学院附属医院 急诊科，河北唐山 063000；2.华北煤炭医学院 病理生理教研室，河北唐山 063000）

牛磺酸对大鼠肢体骨骼肌缺血再灌注后内质网应激反应的影响

浦践一1，赵 琪2，门秀丽2#，张艳敏1，张连元2

（1.华北煤炭医学院附属医院 急诊科，河北唐山 063000；2.华北煤炭医学院 病理生理教研室，河北唐山 063000）

目的：观察牛磺酸（Tau）预处理对大鼠肢体缺血再灌注（IR）后内质网应激反应的影响。方法：制作大鼠肢体IR损伤动物模型，将大鼠随机分成对照组、IR组和Tau组，测定各组骨骼肌组织湿/干（W/D）、活性氧（ROS)、丙二醛（MDA）、黄嘌呤氧化酶（XOD)、超氧化物歧化酶（SOD）含量，采用Western blot和实时聚合酶链反应法测定骨骼肌内质网应激（ERS）蛋白-葡萄糖调节蛋白94（GRP94)表达水平，分析牛磺酸对肢体IR损伤与ERS的关系。结果：与 IR 组比较，Tau组大鼠骨骼肌组织 ROS、MDA、XOD 和 W/D 均显著降低（P＜0.05，P＜0.01），而 SOD活性显著增加（P＜0.05），GRP94在蛋白及mRNA水平表达下调。结论：牛磺酸对肢体IR损伤的保护作用与减轻骨骼肌ERS反应有关。

牛磺酸；缺血再灌注；内质网应激；肢体

Author's addressDepartment of Emergency，The Affiliated Hospital，North China Coal Medical University，063000，Tangshan Hebei，China

肢体缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR）损伤是临床一种常见的病理过程，如：断肢再植、四肢大血管栓塞的解除或损伤的修复、严重的肢体挤压伤及肢体手术时长时间应用止血带等。但迄今这种损伤的确切机制仍不十分清楚。再灌注时产生的氧自由基和细胞内钙超载可能是肢体IR损伤重要的发病环节[1]。已有研究表明，内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）参与了脑组织的IR损伤[2]，我们的前期工作也表明ERS反应参与肢体缺血再灌注损伤的发生，但牛磺酸对肢体IR损伤过程中ERS的影响至今尚未见报道。我们通过制作大鼠肢体IR损伤模型，观察牛磺酸对骨骼肌葡萄糖调节蛋白94（glucose-regulated protein 94，GRP94）表达的影响，探讨 ERS在大鼠肢体缺血再灌注损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

健康雄性Wistar大鼠30只，体重200～250g，随机分成3组，每组各10只，喂养14d。（1）对照组：常规饲养；（2）缺血再灌注（IR）组：常规饲养；（3）牛磺酸（taurine，Tau）组：动物饮水含 1%牛磺酸，喂养 14d[1]。

1.2 动物模型复制

术前12h禁食，IR组和Tau组按本室成功构建的方法[3]，复制动物模型，即：乙醚浅麻醉下，用止血带于双后肢根部结扎，4h后松带恢复血流灌注。对照组除了不结扎肢体外，操作同其余2组动物。

1.3 方法

1.3.1 样品采集及检测

全部动物于实验第6h末经颈动脉放血处死，迅速取出股四头肌，液氮冷冻保存。骨骼肌活性氧（reactive oxygen species，ROS)、 丙二醛（malondialdehyde，MDA）、黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD)、超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）含量测定采用比色法，按试剂盒说明书操作（南京建成生物制品公司）。

1.3.2 骨骼肌组织湿/干（wet/dry，W/D）的测定

取股四头肌组织约300mg，用滤纸吸净表面血迹后称重，置于80℃烤箱烘干72h后取出称干重，计算其比值。

1.3.3 骨骼肌组织GRP94 mRNA表达检测

采用RT-PCR方法，取-80℃保存的骨骼肌组织约200mg，抽提总RNA，扩增。引物序列：GRP94： 上 游 引 物 5＇-GACGGG CAAGGACATCTCTACAAA-3＇， 下 游 引 物 5＇-CTTCTTCTTCTGCCCCTGCGT CTG-3＇（预扩增片段 362 bp）[4]；β-actin： 上游引物 5＇-GACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3＇，下游引物 5＇-ATAGAGCCACCAATCCACACAGAG-3＇（预扩增片段173 bp）。 反应条件：94℃预变性 3min，94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 45s，35 个循环，最后 72℃延伸8min。取PCR产物10μl，产物经2%琼脂糖凝胶电泳，采用北京航空学院图像分析管理系统软件进行扫描。

1.3.4 骨骼肌组织GRP94蛋白的表达检测

采用Western blot方法。取液氮冻存的各组大鼠骨骼肌组织各200mg，加入0.5 ml的组织蛋白裂解液，用匀浆器将组织研碎，4℃离心，取上清，按Bradford法测量蛋白浓度。取100μg样本，于100℃水浴3min后上样进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，湿转移法将蛋白条带转移至PVDF膜上，封闭，分别加入GRP94一抗（1：500）和βactin一抗 （1：500），置4℃冰箱振荡孵育过夜，TBST洗膜后，加入HRP标记的二抗（1：20 000）室温反应1 h，TBST洗涤后，ECL化学发光试剂于暗室中显影，X光胶片曝光，拍照。

1.4 统计学方法

采用SPSS11.0软件进行数据处理，组间数据比较采用单因素方差分析、q检验。

2 结果

2.1 各组大鼠骨骼肌组织MDA、XOD、SOD、W/D的变化

表1示，与对照组比较，IR组骨骼肌SOD值显著降低 （P＜0.05）， 而 ROS、XOD、MDA 和 W/D均显著升高 （均 P＜0.01）。与IR组比较，Tau组SOD 显著升高（P＜0.05），ROS、XOD、MDA 均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

2.2 各组大鼠骨骼肌组织GRP94 mRNA表达（图 1）

与对照组比较，IR组大鼠骨骼肌GRP94基因表达水平上调，但Tau组GRP94基因表达水平下降，但仍高于对照组。

2.3 各组大鼠骨骼肌组织GRP94蛋白表达（图2）

表1 各组大鼠骨骼肌组织ROS、MDA、XOD、SOD和W/D值 （n=10）

与对照组比较，IR组大鼠骨骼肌GRP94蛋白表达水平上调，但Tau组大鼠骨骼肌GRP94蛋白表达水平较IR组下降，见图2。

3 讨论

内质网是真核细胞中重要细胞器，具有折叠、翻译蛋白及维持细胞内钙稳定的作用。ERS是指由于某种原因使得细胞内质网生理功能发生紊乱的一种亚细胞器病理过程。正常情况下，内质网内环境的稳定是实现内质网功能的基本条件，因此内质网具有极强的内稳态体系。尽管如此，仍有很多因素可导致内质网功能的内稳态失衡，缺血再灌注时缺氧、酸中毒、ATP耗竭、钙超载及大量自由基生成等均可作为诱导ERS的刺激因素，而氧化应激是引起缺血再灌注损伤的重要原因，ERS在缺血再灌注损伤的发生发展中具有重要意义[5]。GRP94也称免疫球蛋白结合蛋白，是ERS的经典标志物之一，相对分子量为94 000。细胞内钙失稳态、自由基超负荷、内质网腔内错误折叠蛋白的聚集均可引发ERS，使GRP94蛋白表达上调。GRP78和GRP94分子伴侣具有帮助未折叠蛋白折叠或促进错误折叠蛋白正确折叠的作用[6]。由此可见，GRP94表达上调是ERS的标志之一。宋小燕等[7]研究发现，大鼠脑IR后GRP78表达上调。我们以前的研究结果表明肢体IR后骨骼肌的损伤与氧化应激密切相关[8]，本研究结果也显示，肢体IR后4h，骨骼肌组织中ROS、MDA和XOD水平升高，而抗氧化酶SOD活性降低，说明氧化应激参与了肢体IR后骨骼肌的损伤，同时我们还观察到与此同时肢体骨骼肌组织GRP94基因和蛋白表达上调，表明肢体IR可诱发骨骼肌的ERS反应，而且骨骼肌ERS反应可能与氧化应激有关；与IR组比较，牛磺酸预处理后骨骼肌组织GRP94基因的表达下调，ERS减弱，同时骨骼肌组织中ROS、MDA和XOD水平降低，而抗氧化酶SOD活性升高，推测牛磺酸减轻ERS可能与其抗氧化作用有关，因此干预ERS可能为治疗IR损伤提供新的靶点，但具体机制有待进一步研究。

[1]门秀丽，张连元，董淑云，等.牛磺酸对大鼠肢体缺血再灌注后肺损伤时细胞凋亡的影响[J].中国病理生理杂志，2004，20（3)：421-424.

[2]Liu HJ，Yang JP，Wang CH，et al.Endoplasmic reticulum in the penumbra following middle cerebral artery occlusion in the rabbit[J].Neurol Sci，2009，30（3)：227-32.

[3]张连元，杨林.生理科学实验教程[M].北京：人民军医出版社，2001.29.

[4]万义福，许宝华，张玉珍，等.大鼠严重烧伤后心肌细胞GRP94表达变化及其意义 [J].中国比较医学杂志，2008，18（2)：43-47.

[5]祝筱梅，刘秀华.内质网应激与缺血再灌注损伤及其防护[J].国际病理科学与临床杂志，2006，26（2)：177-180.

[6]娄利霞，唐朝枢.内质网应激与心血管疾病[J].中国分子心脏病学杂志，2005，5（2)：496-499.

[7]宋小燕，赵永波，周晓琳，等.大鼠脑缺血再灌注后内质网应激相关因子表达的改变[J].中国神经精神疾病杂志，2007，33（10)：624-626.

[8]彭军，张连元，门秀丽，等.大鼠肢体缺血再灌注过程中血及骨骼肌的相应指标变化[J].中国病理生理杂志，2005，21（7)：1424-1425，1439.

Effects of taurine on endoplasmic reticulum stress after limbs skeletal muscle ischemia-reperfusion inrats

PU Jian-yi，ZHAO Qi，MEN Xiu-li，et al//Journal of China-Japan Friendship Hospital，2010 Aug，24（4）：223-225

Objective：To investigate the effect of taurine on endoplasmic reticulum stress after limbs ischemiareperfusion （IR）in rats.Methods：Making the model of limbs ischemia reperfusion injury in rats.Rats were randomly divided into 3 groups（n=10)：control group，IR group and taurine（Tau)group.The contents of reactive oxygen species（ROS)，malondialdehyde（MDA)，xanthine oxidase（XOD)，superoxide dismutase（SOD)and rario of wet/dry（W/D)of skeletal muscle in different group rats were detected.Then Western blot and real timepolymerase chain reaction were used to examine the expression change of glucose regulated protein（94GRP94）of skeletal muscle in different group rats.Results：Compared with control group，the content of ROS，MDA，XOD and W/D in skeletal muscle increased significantly in IR group.The level of SOD in skeletal muscle decreased after reperfusion.The expression of GRP94 protein and GRP94 mRNA increased significantly in IR group.And taurine can down-regulate GRP94 expression in skeletal muscle.Conclusion：The protective role of taurine on limbs IR is related to decrease endoplasmic reticulum stress in rat skeletal muscle.

taurine；ischemia reperfusion；endoplasmic reticulum stress；limb

R363

A

1001-0025（2010）04-0223-03

10.3969/j.issn.1001-0025.2010.04.010

* 本文通讯作者。

浦践一（1975-），男，副主任医师，医学硕士。

2010-05-05

2010-06-10