卵泡液中白细胞介素2、白细胞介素12、白细胞介素18与体外受精-胚胎移植妊娠结局的相关性

王秀霞，王天任，何丽霞，孔琳，徐小延，杨大磊

（中国医科大学 附属盛京医院妇产科，沈阳 110004）

体外受精-胚胎移植技术诞生已经30余年，虽然其临床妊娠率在逐渐增高，但仍停留在40%左右，即在接受治疗的患者中仍然有一半以上不能成功妊娠，即使妊娠的患者也存在高于自然的流产率，实际抱婴回家率仅有25%左右，因此探讨影响体外受精-胚胎移植临床妊娠的因素及预测指标对于提高其成功率具有重要的意义。前期研究结果显示，卵泡液中NK细胞百分比及活化NK细胞百分比增加与体外受精-胚胎移植助孕治疗的不良妊娠结局相关［1］。细胞因子白细胞介素 2（interleukin-2，IL-2）、白细胞介素 12（interleukin-12，IL-12）和白细胞介素18（interleukin-18，IL-18）均有较强的活化 NK 细胞的作用，而且研究证明，在自然妊娠妇女外周血中IL-2、IL-12 和 IL-18 的水平与不良妊娠结局相关［2，3］，但其与体外受精-胚胎移植妊娠结局的关系尚未见报道。本文检测了卵泡液中IL-2、IL-12和IL-18的水平并探讨其与妊娠结局的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择2007年7月至2009年4月在我院辅助生殖中心接受体外受精-胚胎移植助孕治疗的不孕症患者117例，年龄在35岁以下，不孕原因为单纯输卵管阻塞，所有对象均排除其他内分泌疾病，无心、肝、肾等疾病，近3个月来未应用激素类药物，进入周期前所有化验指标均为正常，基础促卵泡激素（follicle stimulating hormone，FSH）水平<10 mIU/L。

1.2 研究方法

1.2.1 超排卵方案：117例研究对象均采用常规长方案，于上一个月经周期的黄体高峰期（即月经周期21 d左右）肌注促性腺激素释放激素（gonadotropinreleasing hormone agonist，GnRH-a，商品名达菲林，易普生公司提供），于本周期月经来潮的第3天应用FSH（商品名果那芬，瑞士雪兰诺公司提供），每日1次，具体剂量根据患者情况150～225 IU不等，皮下注射。持续至卵泡成熟，当有3个卵泡直径≥16 mm，或1个≥18 mm、2个≥16 mm时，结合患者血中激素水平给予人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，HCG，丽珠公司提供）注射，常规为5 000～10 000 IU，注射后34～36 h取卵。

1.2.2 卵子回收和卵泡液的采集和保存：采用B超引导下经阴道取卵术，选择直径≥16 mm的卵泡穿刺取卵，留取第一管无明显血染的卵泡液，排除空卵泡的卵泡液，立即以500g离心10 min，取上清液分装于冷冻管中，置于-80℃冰箱保存备用。收集记录患者的详细资料，包括患者年龄、本周期获卵数、子宫内膜形态、厚度以及妊娠结局等。所有标本的采集均得到本院伦理委员会的通过并征得患者本人同意。

1.2.3 IL-2、IL-12和IL-18水平的测定：应用双抗体夹心酶标免疫分析法检测卵泡液中IL-2、IL-12和IL-18的水平，人ELISA试剂盒（96T）购自美国Bender公司。

1.3 统计分析

计量资料以±s表示，应用SPSS 16.0进行统计分析，组间采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 妊娠组与未妊娠组患者基本特征的比较

117例接受体外受精-胚胎移植助孕治疗的患者根据移植后14 d血HCG水平确定生化妊娠，HCG<20 mIU/ml者为未妊娠组，共58例；HCG>20 mIU/ml、第35天B超下见到原始心血管搏动为妊娠组，共59例。两组患者的年龄、血清激素水平、促排卵所用药物剂量、获卵数等指标无显著差异，具有可比性（表 1）。

表1 妊娠组与未妊娠组基本特征比较（±s）Tab.1 General items between pregnancy group and non-pregnancy group（±s）

表1 妊娠组与未妊娠组基本特征比较（±s）Tab.1 General items between pregnancy group and non-pregnancy group（±s）

Item Pregnancy group（n=59） Non-pregnancy group（n=58） P Age（year） 29.56±3.15 29.83±3.01 0.64 Basal FSH（mIU/ml） 7.09±1.64 7.28±1.65 0.54 FSH duration（day） 9.47±1.96 9.16±2.06 0.39 FSH dosage（IU） 2 085.0±592.5 1 995.0±504.8 0.38 Endometrial thickness on HCG day（mm） 11.12±2.17 10.57±2.19 0.18 Numbers of oocyte retrieved（n） 12.66±7.59 11.93±6.31 0.57

2.2 妊娠组与未妊娠组患者卵泡液中IL-2、IL-12和IL-18水平的比较

未妊娠组卵泡液中IL-2的浓度为（40.89±22.83）pg/ml，高于妊娠组的（36.73±18.53）pg/ml，但无统计学差异（P>0.05）。未妊娠组卵泡液中IL-12的浓度为（1.59±1.58）pg/ml、IL-18的浓度为（131.8±162.35）pg/ml，高于妊娠组的 IL-12 （0.52±0.88）pg/ml和 IL-18（76.10±69.06）pg/ml，差异均有统计学意义（P均<0.05）。

3 讨论

众所周知，T淋巴细胞有Th1和Th2两个亚群，Th1型淋巴细胞主要是细胞毒的杀伤作用，Th2型淋巴细胞主要是免疫保护作用，两者通过各自分泌的细胞因子调节体内免疫功能。成功妊娠的建立和维持需要Th1和Th2功能的平衡，Th1型淋巴细胞功能占主导时，可导致妊娠失败。前期研究结果显示，卵泡液中活化NK细胞浓度和干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）浓度的增加均与体外受精-胚胎移植临床妊娠失败相关，而TNF-α与卵丘颗粒细胞凋亡相关［4］。细胞因子IL-2和IL-12是Th1型主要细胞因子，IL-18是重要的炎性细胞因子，是Th1细胞的辅助因子，三者均具有刺激NK细胞活化、分泌IFN-γ等细胞因子、发挥细胞毒的作用。研究证明，习惯性流产患者血中上述3种细胞因子水平均增加，提示其参与胚胎的免疫耐受，在妊娠调节方面具有重要作用，因此其在体外受精-胚胎移植中的作用受到了关注［2，3］。

Ledee等［5］检测了卵泡液中细胞因子水平和其对应的卵子发育状态两者间的相关性，结果显示卵泡液中IL-2的浓度与胚胎早期卵裂相关，表明IL-2对于早期胚胎发育可能起到促进作用，而IL-12水平则与胚胎碎片率有关。另有研究显示卵泡液中IL-12与卵细胞成熟及受精相关，IL-12浓度越高，成熟度越差，受精率越低，因此提出卵泡液中IL-12水平可作为预测体外受精-胚胎移植阴性结局的指标［6，7］。Ledee-Bataille［8］探讨了接受体外受精-胚胎移植患者取卵日宫腔分泌物中IL-18水平，结果显示含量高者妊娠率低；Gutman等［9］证实了卵泡液中存在IL-18，并认为体外受精-胚胎移植患者超排卵周期卵泡液中IL-18浓度比自然周期增高，并证实发生卵巢过度刺激综合征的患者成熟卵泡IL-18浓度高于未发生卵巢过度刺激综合征的患者。但其与体外受精-胚胎移植临床妊娠结局的关系尚未见报道。

本研究检测了接受体外受精-胚胎移植妊娠与未妊娠患者卵泡液中IL-2、IL-12和IL-18的浓度，结果显示卵泡液中IL-2浓度与临床妊娠结局无相关关系，而IL-12和IL-18浓度均为妊娠组低于未妊娠组，具有统计学差异（P＜0.05）。IL-2作为Th1细胞因子具有活化NK细胞、使其分泌IFN-γ的作用。前期研究结果显示卵泡液中活化的NK细胞及卵泡液中IFN-γ与不良的妊娠结局相关，但本研究却未获得其与不良妊娠结局相关的结果。结合Ledee［5］研究的卵泡液中IL-2与胚胎早期卵裂相关，提示卵泡液中IL-2可能未发挥Th1因子的刺激NK细胞活化、继之产生IFN-γ等细胞因子而导致不良结局的作用，而是发挥了促进胚胎发育的积极作用。但其调节机制尚不清楚。如前所述，卵泡液中IL-12水平增高与胚胎质量下降相关，推测在卵巢中各卵泡间存在渗透作用或某种诱因导致各卵泡液中IL-12增高，使所获卵子质量总体下降，进而影响胚胎种植，导致临床妊娠失败。此推论尚需对卵巢中不同卵泡液和卵巢动脉血中IL-12水平进行检测才能证明。IL-18水平增高与不良的妊娠结局相关，推测是由于激活卵泡液中NK细胞，分泌细胞因子；而且在IL-12的协同作用下，IL-18具有促进体内免疫向Th1方向转化作用；最新研究显示IL-18还能使γδT细胞增殖，使IFN-γ和TNF-α等细胞因子分泌增加［10］。经此3种调节途径使卵泡内环境中Th1型细胞因子增加，导致卵母细胞发育不良以及渗透至子宫内膜使种植窗条件改变，影响胚胎种植，最终导致妊娠失败。此推论有待今后进一步研究。

探讨细胞因子与体外受精-胚胎移植妊娠结局的关系，将为临床应用药物调节体内免疫状态、改善临床妊娠结局提供理论基础和监测指标，对提高体外受精-胚胎移植临床妊娠率具有重要意义。

［1］王秀霞，张合龙，何丽霞，等.卵泡液中NK细胞及其活化与体外受精结局关系的探讨［J］.中国医科大学学报，2009，38（10）：770-772.

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［4］王秀霞，易晓芳，何丽霞，等.卵泡液中肿瘤坏死因子α和γ干扰素水平对体外受精妊娠结局的影响［J］.中国实用妇科与产科学杂志，2009，25（11）：859-860.

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［8］Ledee-Bataille N，Olivennes F，Kadoch J，et al.Detectable levels of interleukin-18 in uterine luminal secretions at oocyte retrieval predictfailureoftheembryotransfer［J］.HumReprod，2004，19（9）：1968-1973.

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