自动控温冷水池设计及其在水稻低温敏核不育系选育上的应用

汤国华，余应弘，谢红军，曾 翔，张建华，吴善德

（1.湖南省水稻研究所，国家水稻改良中心长沙分中心，湖南 长沙 410125；2.湖南省农业科学院，湖南 长沙 410125；3.贺家山原种场，湖南 常德 415900；4.中国科学院亚热带农业生态研究所，湖南 长沙 410125）

我国近20年两系杂交水稻繁制种的实践表明：只有不育系生理不育起点温度低（17℃左右）和制种季节不育系育性转换敏感期不育起点温度仍然低（不高于23℃）、且短期低温育性不易恢复，才能有效降低繁制种的育性风险。然而由于不育系低世代的选择压力不够，育成的不育系往往起点温度高，繁制种风险大。为增加水稻低不育起点温度光温敏不育系的选择压力，提高选育效率，加快选育进程，2008年，笔者研究组设计建造了2个共40 m2的自动控温冷水池。2010年，又完善设计、建造了3个共90 m2的自动控温冷水池。3 a的使用效果表明，自动控温冷水池在水稻实用低温敏不育系选育中应用广泛。

1 自动控温冷水池的设计与工作原理

为提高水稻光温敏不育系的选育效率，2008年，以19℃以下的地下水为水源，设计、建造了2个共40 m2的自动控温冷水池。3 a的使用结果表明，自动控温冷水池具有以下特点：（1）控温效果好。水温变化在±0.2℃之间。（2）能耗低。每天耗电约0.5度/m2，远低于人工气候室（每天 15～20度/m2）和人工制冷水池。（3）建造成本低、设计简单、处理量大。凡有低温地下水或自然低温冷水的地方均可建池。（4）筛选核心单株的可靠性好。以湖南农业大学水稻研究所用自动控温冷水池加压选育的33S为例，2010年省生态鉴定表现不育起点温度低且对短期低温钝感。33S分期播种镜检和套袋自交结果如下：4月7日开始播种，7月10日始穗，7月9日至7月21日镜检，100%为典败；7月25日至9月7日镜检，为无花粉型；8月26、27日连续2天日平均气温21.1 ℃，9月11日至9月16日育性发生波动，可育花粉率0.74%～3.67%，平均1.98%，套袋自交结实率均为0；9月17日至9月28日又转为无花粉型。

1.1 自动控温冷水池的设计

选地下水丰富，隔离条件好的地方打井，井的口径及深度以3 m和12 m左右为宜，一般12 m深的地下水水温在19℃以下。按2 m×15 m建筛选池和繁殖池，建池数量根据需要确定，但至少应建1个筛选池和1个繁殖池。冷水池水泥底防漏，池深45 cm左右。水池两侧中间处安装带喷水孔的水管，自动控温仪与供水系统（潜水泵）、温度感应器（探头）相连，探头置于水池和水深的中间部位。冷水池四周设排水沟，池壁设不同深度的溢水口，所有排水沟相连。

1.2 自动控温冷水池的工作原理

不育系处理时期要求气温高于处理水温，井水温度低于处理水温。处理不育系前，先接通电源，把控温旋扭调到所需温度，把探头置于空中，抽水机开始抽水，水深达到要求后，把探头置于水层中部，抽水机立即停止抽水。随后水温缓慢上升，当控温仪显示的水温与设置的水温一致时，放入待处理的不育系。控温仪控温幅度设置为±0.5℃，即水温高于设定温度0.5℃时，抽水机开始供水，水温低于设定温度0.5℃时抽水机停止供水，如此循环往复，完成不育系的低温处理。设置控温幅度可避免抽水机频繁工作，节约用水。处理温度可根据需要设昼夜变温。

2 自动控温冷水池在水稻实用低温敏核不育系选育上的应用

2.1 不育株繁殖

大量不育株得不到种子是育种者最为头痛的问题，为得到种子，通常的做法是把不育株禾蔸带海南繁殖。带不育系禾蔸海南繁殖既繁琐又影响选育进度，用21℃的冷水处理不育株12～15 d，可基本保证不育株都能得到种子。

2.2 低生理不育起点温度不育株筛选

生理不育起点温度低的水稻光温敏不育系具有良好繁殖习性。目前大面积应用的水稻光温敏不育系繁殖方法中的海南冬繁和高海拔稻作区繁殖，都要求不育系的生理起点温度低，即不育系的抗寒性强。抗寒性强的普通水稻品种表现遇低温仍能正常结实。抗寒性强的水稻低温敏不育株，经21℃日平均水温处理12～15 d，没有明显的冷害症状，结实好，籽粒饱满，色泽金黄；而不抗寒的不育株则有明显的冷害症状，结实差，种子色泽暗淡带斑点。因此，低生理不育起点温度不育株的筛选可按上述原则。

2.3 低不育起点温度不育株筛选

不育系育性转换敏感期的不育起点温度必须低，是水稻实用低温敏不育系的首要条件。低不育起点温度不育株筛选的方法，是把处于敏感期的不育株在日平均23℃的冷水中处理7 d，处理结束后的第2天对剑叶叶枕距0～4 cm的单穗进行标记，一般每个单株标记1～2穗。抽穗后标记穗镜检并结合自交，镜检合格并自交不结实的单株当选。

2.4 短期低温钝感不育株筛选

一个制种风险小的不育系，不仅要求5 d日平均气温不低于23℃条件下完全不育，而且要求短期日平均气温23℃以下育性不易恢复。短期低温钝感不育株筛选，一般在F5后进行，方法是用日平均21℃、22℃、22.5℃的水温分别处理 1、2、3 d，选自交结实率低于3%单株。

2.5 不育系光温反应类型鉴定

不育系稳定后，从3月底开始分期播种，每10 d播1次，在不育系主穗进入幼穗分化5期(剑叶露尖前后)移入自动控温冷水池处理，用日平均水温23℃处理7 d，每10～15 d处理1次，每次处理10蔸左右，8月底处理完最后一批。每次处理结束后第2天，标记剑叶枕抽出0～4 cm单穗1～2个，抽穗后镜检并隔离自交，考查花粉育性和自交结实率。排除敏感期有低于23℃日平均气温的处理后，凡花粉育性和自交结实率不随处理时期变化或变化很小的，即为低温敏型不育系，反之，则为光敏型或光温互作型不育系。对低温敏型不育系，可以在日平均气温高于不育系育性转换起点温度的任何时期进行提纯和核心种子生产；对光敏型或光温互作型不育系只能在较短日长条件下（与制种时不育系敏感期日长一致或略短）进行提纯和核心种子生产。

2.6 水稻实用低温敏不育系的选育程序

水稻实用低温敏不育系的育性必须同时达到以下标准：（1）制种季节的不育起点温度低。制种时敏感期遇5 d日平均23℃气温完全不育。（2）对短期低温钝感。短期低于23℃的气温育性不易恢复，在一定有效繁殖积温范围内，随有效积温增加而育性恢复越好。（3）生理不育起点温度低，为17℃左右。

低生理不育起点温度、低不育起点温度不育株的加压筛选、不育株繁殖等必须有机结合起来。一般在正季种植F2，并要求稀植和分次追肥，以保证有足够的稻穗供选择、低不育起点温度筛选和繁殖用。抽穗开花后镜检当选的不育株一分为二，分别用于加压筛选和繁殖，23℃日平均水温处理7 d镜检无可育花粉、自交不结实且21℃冷水处理繁殖的种子籽粒饱满、色泽金黄的的单株，表明其不育起点温度和生理不育起点温度均低。海南利用自然低温对抗寒性、繁殖习性和不育起点温度进行加压选择。自动控温冷水池和海南自然低温加压选择均以株1S为对照，要求当选单株的不育起点温度不高于株1S。

选育至不育系表现型一致后，用短期低温对不育系进行加压选择，筛选短期低温不育性不易恢复的单株，并对不育系的光温反应类型进行鉴定。

3 利用自动控温冷水池进行不育系提纯和核心种子生产

3.1 基础种子生产

基础种子是指用于筛选核心单株的种子。它是更高级别核心种子，用其筛选核心单株和生产用种后，经验证并达到要求。其生产程序是：单株选择→低温冷水或适宜日长低温冷水处理→核心单株→核心种子（基础种子）；其验证程序是：基础种子→原种→大田鉴定和自动控温冷水池鉴定。大田鉴定主要是鉴定其纯度，自动控温冷水池鉴定主要是鉴定其不育起点温度。对温敏型不育系可在日平均气温高于不育系不育起点温度的时期鉴定，对光温互作型不育系在与不育系制种季节一致的时期鉴定，其鉴定指标是日平均水处理5 d镜检和隔离自交合格。

经验证后的基础种子冷库贮藏，分年分批用于核心种子生产，基础种子生产量以5～10 kg为宜。基础种子的主要优点是筛选核心单株的效率高，大田用种可靠性好，制种育性风险小。

3.2 核心种子生产

温敏型不育系与光温互作型不育系互相种子生产的区别在于：温敏型不育系不受时期限制，光温互作型不育系互相种子生产必须与制种季节不育系育性敏感期日长相同或稍短。因此，利用自动控温冷水池筛选的温敏型不育系的核心单株可利用水库低温冷水正季分蔸大量繁殖核心种子；光温互作型不育系核心单株筛选在长沙以8月上中旬进行为宜，8月下旬至9月上旬抽穗后在当地不能再生繁殖，只能带核心单株海南2次分蔸扩繁。

3.2.1 温敏型不育系核心种子生产 温敏型不育系核心种子生产程序是：基础种子→自动控温冷水处理→核心单株→分蔸冷水串灌繁殖→核心种子。处理水温为日平均23℃，可设昼夜变温；处理时期为幼穗分化5期，即部分单株主穗剑叶露尖；处理时间为7 d；处理数量根据处理池大小、数量和核心种子需求量确定。处理结束后第2天每株标记最敏感单穗1～2个，标准为剑叶叶枕抽出0～4 cm。抽穗后拔除明显可育株，敏感穗隔天镜检一次，连检3次。如季节不紧张也可结合自交结实情况选择核心单株，核心单株当选指标为镜检和自交结实与对照株1S相当。当选核心单株割蔸后利用水库冷水分蔸繁殖，一般30 m2水池可处理900株左右，当选核心单株500株左右，3个处理池处理2次可得核心单株3 000个左右，分蔸后可种植700 m2，生产核心种子250 kg左右。

3.2.2 光敏型、光温互作型不育系核心种子生产光敏型、光温互作型不育系核心种子生产程序是：基础种子→适宜日长自动控温冷水处理→核心单株→海南2次分蔸繁殖→核心种子。处理时期与制种季节不育系敏感期日长相近或略短，在长沙以8月中下旬为宜；不育系栽培管理上要求培育不整齐的苗穗，使不育系处理结束后7 d后仍有较多处于敏感期的稻穗，保留标记穗，剪除非敏感期稻穗，用自动控温冷水处理12～15 d，当选单株收种后禾蔸带海南2次分蔸繁殖。试验结果表明，一个不育系禾蔸海南分蔸2次，可插40蔸左右，繁种0.5 kg左右。对使用量大的不育系，可筛选1 000个以上的核心单株海南分蔸繁殖，生产核心种子500 kg以上，冷藏后逐年用于原种生产。

水稻光温敏不育系不育起点温度越高或经多代繁殖，其制种风险越大。增加不育系早世代的选择压力，采取合适的核心种子生产程序大量生产核心种子，核心种子繁殖原种用于制种，可保证制种不育系个体间光、温指标的一致性，减小不育系不育起点温度的漂移，从而降低两系杂交水稻制种风险。

自动控温冷水池设计简单，建造、使用成本低，在水稻低不育起点温度光温敏不育系选育、不育起点温度鉴定、核心种子生产等方面用途广泛。

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