生物技术在昆虫分类中的应用

黄海荣 程 菲 曾 春 王晓红 唐艳龙 姜 静

(1江西省信丰县隘高林场,江西 信丰 331600;2江西省信丰县林业局,江西 信丰 331600;3江西省瑞金市林业局,江西瑞金 342500;4中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所,北京 100091)

目前,已经定名的昆虫有 100多万种,占已知动物的 2/3,但是全世界仍约有 90%的昆虫是未知种[1]。随着科学技术的进步以及各个学科的交叉渗透,已有 200多年历史的昆虫分类学也获得了极大的发展,特别是现代生物技术的应用更加速了昆虫分类学发展的步伐。长期以来,昆虫分类主要是以外部形态特征为依据。因为外部形态特征较为直观,且容易掌握,而根据昆虫的形态特征作为分类依据在目等分类单元中可以很好的反映物种的分类地位。但是,在小的分类单元,如属、族、种内则不容易确定物种的分类地位,再到种群、生态型则更难确定分类地位。20世纪 70年代以来,先后出现了同工酶电泳、气相色谱或气质 -质谱联用技术、核酸序列分析、随机扩增多态性 DNA(RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)、分子杂交技术、单链构象多态性(SSCP)及双链构象多态性(DSCP)技术等多种现代生物技术,极大的促进了昆虫分类学的发展。

1 研究及应用现状

1.1 同工酶电泳技术

20世纪 70年代以来,生物化学研究手段逐渐进入分类学的各个领域,特别是同工酶的研究已成为鉴定物种和种间亲缘关系等方面的重要方法。同工酶是由不同基因位点或等位基因编码的多肽链的单体、纯聚体或杂聚体,其理化或生物性质不同而能催化相同化学反应的酶。同工酶能较好地反映不同昆虫之间的遗传差异,具有可靠的生理特性和物种遗传性,对物种鉴别具有重要的参考价值。由于同工酶是基因的产物,能直接反映基因的异同,易于观察研究,目前已作为一种生化遗传标志广泛地应用于发育生物学、群体遗传学、系统分类学等各个领域[2]。通过物种同工酶的研究,可以推测物种在基因水平的不同,进而可以推测其血缘关系和进化地位[3]。

唐桦等通过酯酶同工酶电泳发现光肩星天牛Anoplophora glabripennis(Motschulsky,1853)和黄斑星天牛 A.nobilis(Ganglbauer,1889)在酯酶带上差异甚微,认为这 2种天牛应归属于同 1个种[4]。张思宇等对 15种不同色斑型异色瓢虫的同工酶进行比较研究,共获得 25个同工酶位点,其中多态性位点 20个,多态位点百分率为 80%,从而明确了其遗传变异的主线[5]。马春燕等分析了蝽科 3亚科、9种蝽象的酯酶同工酶,发现同一亚种内不同属种间的 EST同工酶存在明显差异,但小于不同亚种属种间的差异;蝽亚科和益蝽亚科的亲缘关系较近,而这2个亚科和盾蝽亚科的亲缘关系较远,这与形态学的划分相一致[6]。

1.2 气相色谱或气质 -质谱联用技术

利用气相色谱或气 -质谱联用技术对昆虫表皮中碳氢化合物进行分析,并以此为依据对昆虫进行分类鉴定是近十几年来昆虫分类学发展的一个方面,主要用于近缘种及种群的研究。昆虫表皮中的碳氢化合物是指存在于昆虫上表皮中的碳数为 20～50、直链或支链、饱和或不饱和的长链烃类,是昆虫表皮蜡层中主要成分[7]。据国内外研究报道,昆虫表皮碳氢化合物的组分和含量在种间存在差异,即使在亲缘关系很近的种之间也有明显差异[8]。

张红兵等应用 GC-MS分析表明,不同种类白蚁表皮碳氢化合物组成和含量均有差异。结果表明,我国存在异白蚁属,它与散白蚁属主要区别在于其表皮缺乏以下数种碳氢化合物:正十七烷烃、正二十烷烃、正二十一烷烃、正二十二烷烃、正二十三烷烃、正二十四烷烃和正二十六烷烃等;却含有一种特殊化合物异喹啉。表皮碳氢化合物分析的结果与形态分类的结果有一定差异,形态分类被鉴定为双色散白蚁的 R.sp.1,被鉴定为小头散白蚁的 R.sp.2,被鉴定为圆唇散白蚁的 R.sp.3,被鉴定为尖唇散白蚁的 H.sp.4,根据表皮碳氢化合物分析的结果,R.sp.1、R.sp.3和 H.sp.4可能是其他种,而R.sp.2则可能是圆唇散白蚁的亚种或其他种[9]。

1.3 核酸序列(线粒体 DNA和核糖体 DNA)分析技术

线粒体 DNA为双链闭环分子。昆虫的线粒体DNA大小为 15.4～16.3 kb,其中含有编码 2个核糖体 RNA(12S rRNA,16S rRNA)、22个 t RNA、1个细胞色素 b、3个细胞色素氧化酶 (CO I、CO II、CO III)、6个 NADH降解酶(ND 1～6)和 2个 ATP酶(6和 8)的基因[10]。目前,通常用于昆虫分类研究的基因有以下几种:16S rRNA、细胞色素 b、ND2、CO I、CO II等 。

潘兴丽等以线粒体细胞色素 b(Cyt b)基因作为分子标记,首次对缘蝽科 4亚科 14种昆虫进行序列测定,获得 Cyt b基因 412 bp的序列片段。以筛豆龟蝽为外群构建系统发育树,表明在亚科级关系上,姬缘蝽亚科最原始,蛛缘蝽亚科次之,巨缘蝽亚科和缘蝽亚科亲缘关系较近[11]。姚银花等通过对我国大螟 Sesam ia inferens 9个地理种群的线粒体DNA CO II基因的测序,并分析了大螟不同地理种群之间的 CO II序列的遗传分歧及相似性,同时建立其系统发育关系[12]。

核糖体 DNA是编码核糖体 RNA的基因,是一类中度重复的 DNA序列,以串联多拷贝形式存在于染色体 DNA中。每个重复单位由非转录间隔区(NTS)、转录间隔区 (ITS)和 3种 RNA(18S、5.8S、28SRNA)基因编码区组成[13]。由于 rDNA是生物界普遍存在的遗传结构,具有多拷贝性、编码区保守、转录间隔区中度保守等优点,因而在个体及群体内有较好的均一性,少量样品能有效代表其来源群体的 rDNA的变异情况。因此,rDNA已成为生物系统进化研究中一个非常有用的分子标记[14]。

Flook和 Rowell测定了 29种多新翅类(Polyneoptera)昆虫的 18S rDNA的全序列,并结合 Gen-Bank数据库中的 8种其它昆虫的 18S rDNA全序列,重建了传统的古翅亚部(Palaeoptera)和新翅亚部(Neop tera)昆虫的系统发育,其结果支持直翅目的单系性[15]。刘殿锋等人测定了斑腿蝗科(Catantopidae)10亚科 20种蝗虫和其它蝗科 3种蝗虫的线粒体 16S rDNA部分序列,并从 GenBank中下载了蝗亚目(Locustodea)15个种的 16S rDNA相应序列片段,构建了系统发育树,但分子系统学研究结果和基于形态特征的斑腿蝗科传统分类结果有很大的不同[16]。

1.4 RAPD和 RFLP技术

RAPD技术是由美国杜邦公司的科学家 J.G.K.Williams和加利福尼亚生物研究所 J.Welsh两个研究小组在 1990发展起来的以 PCR为基础的一项 DNA分子水平上的大分子多态检测技术[17]。其原理是用随机序列的 9-10个核苷酸的引物对基因组的 DNA进行 PCR扩增,再进行电泳分离与溴化乙锭染色。RAPD技术具有简便、快捷、灵敏、多态性检出率高、所需 DNA量少等特点,因此被迅速用于个体和品系鉴定、基因的多态分析、基因定位、构建遗传图谱、标记辅助选择和种间遗传分析等领域的研究。目前 RAPD技术已成为昆虫遗传图谱构建中的一种普遍方法,该技术一出现,就被用于蚊虫的分子系统学研究。

南宫自艳等采用 RAPD技术,分析了 5种松毛虫 10个地理种群的种群内、种群间的遗传多样性,检测和描述在不同地理环境条件下的松毛虫种群的遗传结构和变异情况,为松毛虫的综合防治提供有效的依据[18]。赵慧婷等采用 RAPD技术对来自中国境内 8个省市的 28群东方蜜蜂 Apis cerana进行了研究,探讨了它们之间的亲缘关系[19]。

RFLP技术(限制性片段长度多态性分析)是由Bostein在 1980年首先建立并发展起来的一种分子遗传标记技术。它是指应用限制性内切酶切割不同类群个体基因组 DNA或某一基因,产生不同长度的限制性片段,根据酶切图谱,计算类群之间的遗传距离,构建系统树。贾正辉等应用 PCR-RFLP技术对来自四川省 8个地方的枯死松树样品中的伞滑刃属线虫群体进行了分子鉴定。该研究中选用的 4种限制性内切酶(DraⅠ 、SalⅠ 、HhaⅠ 、AluⅠ )除 SalⅠ外均可对所鉴定的 6种伞滑刃属线虫产生特异性的酶切位点,从而均可有效地鉴别出松材线虫、拟松材线虫和其他 4种伞滑刃属线虫,其结果可为今后这几种伞滑刃属线虫的分子鉴定提供一定的参照[20]。

1.5 分子杂交技术

核酸的分子杂交技术是现代分子生物学研究中常用的方法之一,它和克隆技术密不可分,并且在基因表达、调控以及在物种亲缘关系的研究中具有重要作用。最基本的分子杂交技术包括原位杂交技术、Northern分子杂交技术和 Southern分子杂交技术。在昆虫学研究主要应用核酸分子技术检测起遗传的多态性、DNA的同缘性和 mRNA的差异来鉴别昆虫的近缘种以及地理种群。分子杂交的关键是制备特异性强和灵敏度高的探针。目前应用较多的是地高辛和生物素等非放射性标记探针。Lorite等利用原位杂交对叶甲科 Chrysomelidae昆虫 Chrysolina americana的微卫星进行了研究[21]。

1.6 SSCP和 DSCP技术

SSCP技术 (单链构象多态性分析)及 DSCP技术 (双链构象多态性分析)的基本原理相似,都是依据 DNA分子在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,其迁移率除与 DNA的长短有关外,更主要的是取决于 DNA链所形成的构象。SSCP技术自1989年由 Masato Orita等人建立以来,就以其灵敏性广受关注。李石柱等就使用 PCR-SSCP技术对我国多斑按蚊复合体 5个成员种进行了分子鉴别,分析其 28S-D3扩增产物,结果显示电泳条带具种特异性,可用于鉴别各蚊种[22]。DSCP技术在昆虫分类上的应用不多,在国内未见有相关报道。

2 问题与展望

随着生物技术的迅猛发展,以及同工酶电泳、气相色谱或气质 -质谱联用技术、细胞遗传学研究技术、核酸序列分析、RAPD、RFLP、分子杂交、SSCP及DSCP等分子生物学技术在昆虫分类研究中的应用和有益探索,或是解决了传统分类中所存在的学术疑难问题,或是验证了传统分类所得出的结论,已显示出其应有的优势和广阔的发展前景。

然而生物技术在昆虫研究中的应用时间毕竟不长,还存在不少问题。首先是目的基因或 DNA片段的选择,如何在庞大的昆虫 DNA文库中选择最有利于昆虫分类、最能反映其进化关系的基因或 DNA片段,仍存在较大难度。其次是用不同的目的基因或DNA片段对同一昆虫进行研究,可能会得到不同的结果。再次是分析软件或程序包的应用,目前有大量的分子生物学分析软件,不同的软件或程序包有许多不同的假设和参数,研究者采用不同的分析软件或采用同一软件而设置不同的参数,同样的数据可能会得到不同的结果。如何解决好这些问题是今后昆虫分类科学研究工作中的重要任务。

随着生物技术的迅速发展,实验技术的不断发展和改进,它必然会推动昆虫学在分子水平上的发展。昆虫分类学是昆虫学研究中的基础领域,也是传统领域,可以预见在不远的将来,古老的昆虫分类研究随着不断创新的理论和技术的发展,将有新的更大的成就。

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