细菌内毒素检查的几点体会

张义伟

细菌内毒素检查是利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机制，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法，是控制药品质量的一项重要检测项目。细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法［1］。其中广泛使用的权威的方法是凝胶法。随着细菌内毒素检查法系统工程的标准化，药品越来越多的家兔热原检查法被细菌内毒素检查法所取代。笔者根据实际工作经验，归纳在细菌内毒素检查中的几点体会，以资参考。

1 影响细菌内毒素检查的因素

细菌内毒素检查操作过程应严格按照无菌操作法，防止微生物的污染。实验室应保持洁净，实验前应紫外灯灭菌1 h，在百级净化台上操作，动作尽量轻、小，防止试管受到振动。检查所用器皿均应彻底洗涤干净，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250℃干烤至少60 min。凝胶法细菌内毒素检查用水的内毒素含量应小于0.015 ml～1。某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液，一般要求供试品溶液的PH值在6.0～8.0的范围内［2］。在此范围内才能形成最佳凝集，PH值过高或过低均可破坏极微量的内毒素，也可影响鲎试剂与内毒素凝集反应过程。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液(或其稀释液)的PH值。试液的每一步稀释应在旋涡混合器上混匀。总之，尽可能避免假阳性或假阴性结果。

2 内毒素限值的确定

一个新品种的内毒限值确定的妥当与否，直接决定了对药品本身所允许的内毒素含量标准质量的评价要求［3］。尽管细菌内毒素检查方法的建立是一个科学方法的研究过程，但其最终目的还是要为控制药品质量服务。因此，在方法建立时，不但要阐明限值的合理性，考虑技术可能达到的限值，同时还要满足相关药品管理法规的要求。标准要求太高可能会使正式生产时很多产品不能通过检查，从而造成不必要的浪费，太松则不能保证药品质量，危及临床用药安全。细菌内毒素限值(L)一般按以下公式确定，L=K/M。K为人每公斤体质量每小时最大可接受的内毒素剂量，以Eu/(kg· h)表示，注射剂K=5Eu/(kg·h);M为人用每公斤体质量每小时的最大供试品剂量，以ml/(kg·h)、mg/(kg·h)或u/(kg·h)表示，人均体质量按60 kg计算，注射时间若不足1 h，按1 h计算。在计算过程中应注意单位的一致性。在细菌内毒素检查中，细菌内毒素标准品和鲎试剂常常以Eu/ml表示，所以具体实验中样品的内毒素限值可以转换为Eu/ml的。如某产品的内毒素限值为0.1Eu/mg，浓度为100 mg/ml，内毒素限值L=0.1(Eu·mg)·100(mg· ml)=10Eu/ml。注射剂临床应用很多品种是联合用药，如一瓶输液中可能加入多种药物，也有几瓶输液同时注射。因此，在实险室对新品种内毒素理论限值计算后，还应结合多种因素，综合考虑其内毒素限值的确定，这一点是很多药学工作者所忽略的。

3 应注意细菌内毒素的“迭加现象”

试验中使用的细菌内毒素检查用水或其他材料均可能存在少量内毒素，但只要不超过鲎试剂的灵敏度，就不能检出，然而它可增加供试品中含有的内毒素量，使其刚好在灵敏度限值以上，引起阳性反应。尽管出现这种“假阳性实验”的情况是不可避免的，但可采用至少比供试品内毒素限值更小的鲎试剂来检查细菌内毒素检查用水或其他材料，减少这种“假阳性实验”的出现。这种供试品的“假阳性实险”反应是安全的，因为供试品本身存在内毒素含量低于限值，它与含有超过内毒素限值，而被错误的通过是不同的。

4 错误认为一定要按最大有效稀释倍数(MVD)或最小有效浓度(MVC)进行试验

实际上，有的样品浓度很高也不干扰鲎试剂与内毒素的凝集反应。这种情况下，只要供试品内毒素含量合格，可以在MVD范围之内，即小于MVD的倍数下进行试验，又如对样品检查时，也可以先用原液进行干扰实验，如无干扰，内毒素检查也能合格，则不必进行稀释。这样做的直接好处是可以节约成本和时间，减少污染环节。因此通过干扰实险，找到一个适当的不干扰试验的供试品浓度，从而使操作更为便捷、经济。

5 试验结果的判断

细菌内毒素检查须阴性对照溶液均为阴性，供试品阳性对照溶液和阳性对照溶液均为阳性，试验方为有效。供试品溶液管均为阴性，判供试品符合规定，如均为阳性，判供试品不符合规定。若有一管为阴性，另一管为阳性，需进行复试。复试时供试品溶液需做4支平行管，若均为阴性，判供试品符合规定，否则判供试品不符合规定。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部).化学工业出版社，2005:附录 85-87

［2］郭录平.浅谈影响鲎试验的影响因素.中国药学杂志，1996，31(3):187.

［3］周孝文，李波.细菌内毒素检查法常见问题.中国药学杂志，2006，41(19):1516.