集落刺激因子对慢性脑缺血成年鼠胶质细胞可塑性及记忆改善的影响

舒细记 柳威 周红艳 熊巍鹏 陈艳华 艾永循

有关慢性脑缺血损伤后认知障碍的康复治疗一直是临床热点，以往多关注神经细胞的修复对认知预后的影响。目前研究发现，胶质细胞的修复对认知功能改善的作用同样至关重要，胶质细胞可以通过改变自身特性以适应内外环境的损伤刺激而具有可塑性，包括细胞数量的增加，细胞胞体突起长度上的变化，非星状及放射状细胞向星形胶质细胞的形态转化等，其中以细胞胞体突起长度变化最为明显［1］。胶质细胞可塑性在神经信息传递、整合和调控等促进认知改善的过程中起关键作用［2］。重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)对于造血细胞的生长和分化起重要介导作用，具有刺激骨髓干细胞迁移、增殖、分化、成熟等生物学功能。本研究构建慢性脑缺血模型，从胶质细胞可塑性改变及学习记忆功能改善的角度，探讨rhG-CSF对慢性脑缺血损伤的修复作用。

1 材料与方法

1.1 建模与分组 3月龄雄性清洁级SD大鼠45只，体重(287±37)g，随机分为缺血组、对照组和干预组，每组15只。1%戊巴比妥钠35～40 mg/kg麻醉大鼠，分离并结扎双侧颈总动脉，作为缺血组。假缺血的对照组仅分离双侧颈总动脉但不结扎。大鼠术后再常规饲养6个月，期间有8只死亡，最后存活鼠缺血组11只、对照组14只、干预组12只。干预组rhG-CSF(齐鲁制药公司产品)的剂量为10 μg/kg;缺血组、对照组采用生理盐水作为安慰剂，均皮下注射，手术6个月后连续3 d，停药5 d，完成学习记忆功能评估后立即处死大鼠，取材制片。

1.2 学习记忆功能评估 通过定位航行实验评估大鼠空间学习能力，空间探索实验评估大鼠空间记忆能力。评估实验前1 d，让大鼠在无逃逸平台的水池中适应性游泳2 min。定位航行实验：连续5 d，每天上午同一操作者将大鼠面向池壁从不同象限入水，找到平台后站立15 s，记录其找到隐匿平台所耗的逃逸时间，再从平台上移开休息60 s后进行下一轮实验。若在120 s内大鼠未找到平台，由操作者引导上平台，逃逸时间记为120 s。空间探索实验：完成定位航行实验后撤去平台，将大鼠从平台所在的对面象限中放入水池，记录2 min内大鼠穿过平台所在区域的次数及停留于平台所在象限的时间。

1.3 海马胶质细胞可塑性的图像分析 4%多聚甲醛全身灌注固定，取含海马结构的组织制片。免疫组化染色采用即用型GFAP抗体及PV-9000试剂盒完成。设PBS为一抗阴性对照、已知阳性切片为阳性对照，GFAP以细胞质出现棕色颗粒为阳性。采用MOTIC Med 6.0分析系统进行图像分析。在海马CA1区随机选定起始区后连续采集5个“400?”视野，以“个/视野”为单位记录GFAP阳性细胞数。同时，每个高倍视野随机选取10个形态明确胞质突起完整的GFAP阳性细胞，记录每个待测细胞最长胞质突起的长度(μm)。

2 结果

2.1 rhG-CSF对空间学习记忆能力的影响 定位航行实验中，随着训练天数的增加，各组大鼠找到隐匿平台的逃逸潜时间逐渐减少(表1)。缺血组的整体逃逸时间明显多于对照组(P＜0.01)，干预组逃逸时间明显少于缺血组(P＜0.01)。空间探索实验中，缺血组大鼠停留于平台所在象限的时间(12.16±4.33)较对照组(19.32±5.41)明显减少(P＜0.05)，缺血组大鼠穿过平台的次数(4.36±1.95)较对照组(11.08±3.74)明显减少(P＜0.01)。干预组大鼠停留于平台所在象限的时间(15.76±4.53)明显高于缺血组(P＜0.05)，干预组大鼠穿过平台的次数(8.47±2.71)明显多于缺血组(P＜0.05)。

2.2 海马CA1区的胶质细胞可塑性观察 就胶质细胞数量变化而言，缺血组(28.67±5.97)海马CA1区GFAP阳性细胞数目较对照组(59.48±8.63)明显减少(P＜0.01)，干预组海马CA1区GFAP阳性细胞(39.25±4.83)较缺血组明显增多(P＜0.05)。就胶质细胞胞质突起变化而言，缺血组海马CA1区GFAP阳性细胞胞质突起的平均长度(167.57±35.74 μm)较对照组(256.74±45.27 μm)明显缩短(P ＜0.05)，干预组GFAP阳性细胞的胞质突起平均长度(196.43±26.83 μm)较缺血组明显延长(P＜0.05)。

2.3 大鼠空间记忆能力与胶质细胞可塑性的相关性分析 各组大鼠海马CA1区GFAP阳性细胞胞质突起长度的变化与对应的平台所在象限停留时间(r=0.615，F=0.613，P＜0.05)、穿过平台区域次数的变化趋势(r=0.601，F=0.637，P＜0.05)均呈正相关;各组海马CA1区GFAP阳性细胞数量的变化与对应的平台所在象限停留时间(r=0.681，F=6.409，P＜0.05)、穿过平台区域次数的变化趋势(r=0.749，F=9.512，P ＜0.05)呈正相关。

3 讨论

慢性脑缺血是血管性痴呆、Alzheimer、Binswanger等多种慢性脑血管病的共同病理过程，可致器质性中枢神经损伤和功能性认知障碍。rhG-CSF作为一种多潜能的造血生长因子，可动员外周血骨髓干细胞向中枢系统迁移，分化为神经元和胶质细胞，修复中枢系统损伤。海马是脑缺血损伤最敏感的区域之一，与学习记忆等认知功能密切相关。本研究着重探讨rhG-CSF对慢性脑缺血后海马胶质细胞可塑性及记忆功能的影响。

星形胶质细胞为最主要的胶质细胞，GFAP是星形胶质细胞的特异性分子标记物。本研究通过病理组织学观察分析星形胶质细胞可塑性发现，对照组GFAP阳性细胞数量最多、胞质突起长度最长，干预组次之，缺血组GFAP阳性细胞数量最少、胞质突起分支少而短小，部分GFAP阳性细胞胞质突起崩解。通过定位航行实验发现，干预组大鼠逃逸时间显著低于缺血组，提示rhG-CSF干预后慢性脑缺血大鼠学习障碍明显改善。空间探索实验发现，干预组大鼠平台所在象限的停留时间及跨越平台次数均显著高于缺血组，提示rhG-CSF治疗后大鼠记忆障碍明显改善。由此证实，rhG-CSF可有效改善慢性脑缺血大鼠的认知障碍。对照组与缺血组、干预组与缺血组的GFAP阳性细胞数量及胞质突起长度的组间分析，均有统计学差异，前者提示慢性脑缺血对星形胶质细胞的损伤，后者提示rhG-CSF可有效促进缺血海马的星形胶质细胞可塑性变化。

本研究对胶质细胞可塑性与认知记忆改善趋势的进一步相关性分析发现，各组GFAP阳性细胞的数量及其胞质突起长度变化，与大鼠停留于平台所在象限的时间、穿过平台区域次数均呈正相关，提示rhG-CSF可通过激活星形胶质细胞数量增生、胞质突起长度延长等可塑性变化，来促进大鼠空间记忆能力的改善。新生星形胶质细胞可为神经细胞迁移提供脚手架，神经细胞轴突生长沿星形胶质细胞突起形成的架桥爬行迁移，形成有效的轴突通路。同时，新生星形胶质细胞可释放出兴奋性氨基酸、前列腺素等神经活性物质，调控神经元的功能［3］，促进神经元间突触网路的建立，增加传导速度［4］。星形胶质细胞还在突触发生、突触传递的调节中发挥重要功能［5］，是神经信息传递、整合和调控过程中的关键角色［2］，rhG-CSF干预后的胶质细胞可塑性变化，可能是学习记忆损害后功能改善的重要病理修复机制之一。但rhG-CSF通过诱导胶质细胞可塑性变化来改善认知障碍的神经信号传导机制，还有待进一步深入研究。

［1］商永华，王群，陆兵勋，等.慢性脑缺血大鼠学习记忆变化及甲状腺激素的影响.中国康复医学杂志，2007，22(3)：209-211.

［2］Halassa MM，Haydon PG.Integrated brain circuits：astrocytic networks modulate neuronal activity and behavior.Annu Rev Physiol，2010，172：335-355.

［3］Tsuda M，Shigemoto-Mogami Y，Koizumi S，et al.P2X4 receptors induced in spinal microglia gate tactile allodynia after nerve injury.Nature，2003，424(6950)：778-783.

［4］Ullian EM，Sapperstein SK，Christopherson KS，et al.Control of synapse number by glia.Science，2001，291(5504)：657-661.

［5］Eulenburg V，Gomeza J.Neurotransmitter transporters expressed in glial cells as regulators of synapse function.Brain Res Rev，2010，63(1-2)：103-1012.