微生物限度检查法对丸剂的验证

隋玲

本文通过理论分析对丸剂的微生物限度检查方法的验证过程与结果的影响因素。衡量药品合格与否的一项重要指标是药品的微生物限度是否符合要求。微生物限度检查法是检查非规定灭菌制剂及其原、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括染菌量及控制菌的检查，是判断生产单位所用的药用原辅料、设备、工具、工艺流程、生产环境和操作者卫生状况的重要手段和依据。微生物限度检查操作繁琐，要求严格，许多干扰因素都会造成检验结果误差。

1 验证方法

1.1 供试液的制备 《中国药典》［1］规定“当供试品有抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性，再依法检查”。大多数情况下，仅从其处方和生产工艺上难以判别检品是否有抑菌活性，此时的供试液制备的特殊方法，对检验员就无操作性可言。《中国药典》规定，后述细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌验证检品有无抑菌活性是检查方法的验证中的一个重要方面，当建立药品的微生物限度检查方法时，应进行方法验证。因此，为避免检验员操作时的逻辑错误，可将具有抑菌活性的供试品的供试液制备的特殊方法列入计数方法和控制菌检查验证的环节中。

1.2 验证 《中国药典》明确规定，验证计数方法和控制菌检查方法“若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法和控制菌检查方法应重新验证”。但因“药品的组分”和“原检验条件”这两个改变因素，验证标准均未进一步明确。①“药品的组分”从字义上理解有二层含义，一是药品原料中的种类，从药品标准及批准文号方面考虑原料的种类是不会改变的，否则该检品应视为假药;二是原料的来源，当原料的来源发生变化时，只有该检品的生产企业知晓，而除此之外的检测机构却不知晓，因而对“药品的组分”的改变，实际上也无可操作性;②对不同的检测机构而言“原检验条件”一定不同，因此，不同的检测机构的检验方法不全一致;③在方法验证条件中，对同一品种不同生产企业产品，同一品种同一生产企业不同时段生产产品，标准均未作明确的具体规定，这也使检验机构在作方法验证时，不便操作。笔者认为，对何时作计数方法和控制菌检查方法作验证，《中国药典》应更进一步明确、细化。此外，还应将微生物检测实验室的有关设备、仪器的验证，检验中标准菌种使用、保存与管理的验证，消毒剂的使用及效力的验证，培养基、缓冲液、稀释液和试剂的验证，所使用灭菌方法的验证等验证内容纳入微生物限度检查法的验证范围，方能全面完善检测方法的可行性。

2 影响因素的分析

2.1 操作环境的影响 微生物限度检查应有单独的无菌室，环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级，每次操作前用0.1%新洁尔灭或其他适宜消毒液擦拭操作台及可能污染的死角，然后启动层流净化装置，同时用紫外杀菌灯照射30 min。无菌室内应固定存放乙醇灯、火柴、剪刀、碘伏棉等。应在半无菌室进行菌种处理和微生物鉴别，严禁在微生物检查用洁净室操作，否则，将可能造成试验室环境污染或菌种之间的交叉污染。

2.2 设备及用具的影响 凡操作过程中所用的器皿均应洗涤干净，用牛皮纸包扎严密，灭菌。经高压蒸汽灭菌的物品取出时切勿立即置冷处，避免因急速冷却，使灭菌物品内蒸汽冷凝造成负压易染菌，取出后应置恒温培养箱中烘干，待用。各种恒温恒湿培养箱除定期检定外，还应每天观察箱内温度及湿度波动的范围;高压蒸气灭菌器在每次使用时，应放置必要的监视指标，据指示卡的变色情况，判断是否在设定的温度与压力条件下达到灭菌效果。总之，为保证各种器械及设备正常使用均应对其有定期计量与检定记录。

2.3 供试液制备过程的影响 当建立药品的微生物限度检查法时，为保证检验质量，应先进行方法的验证，以确认供试品在该试验条件下无抑菌活性或抑菌活性可以忽略不计。供试品检验全过程必须符合无菌技术要求。供试液稀释及注皿时应振摇后取均匀的供试液，如取上清液或沉淀物对试验结果必然有影响。供试品、稀释剂、培养基都要定量加入，这样可使检查标准化，还可控制试验结果，千万不能估计取量。

2.4 菌落计数误差 菌落计数一般是从平板的背面直接以肉眼点计，计数时应仔细观察、准确判断，平皿边缘和琼脂内生长的菌落不要漏计，同时应注意细菌菌落、霉菌菌落和酵母菌菌落与供试品颗粒、沉淀物、气泡、油滴等的鉴别。培养基注皿后由于供试品稀释液中常含有不溶性原料、辅料，有可能产生沉淀物，这些有形物很难与菌落相鉴别，为了有利于菌落计数，可在操作时将适宜稀释级的稀释液多增加注皿1～2个，注皿后不经培养而放置于冰箱(勿冻结)中，在计数菌落时作为对照。在规定的培养条件下，应严格遵守培养时间，但菌落生长呈蔓延趋势者，细菌点计需在24 h，霉菌点计需在48 h进行初步点计，最终结果细菌以培养48 h的菌落数报告，霉菌、酵母菌以培养72h的菌落数报告。

2.5 菌种的制备及保存 菌种是活的微生物，在菌种的使用保藏过程中需定期传代，且防止变异，微生物检查所用菌种的不得超过5传代，应有专人负责，专用冰箱保存，在应用前，应对菌种的纯度和特性进行确认。

［1］国家药典委员会．中华人民共和国药典(二部)．北京:化学工业出版社，2005，93:101．