耳后进路大鼠耳蜗中阶侧壁显微注射携带EGFP慢病毒的实验研究*

潘 松，付 勇，刘 杰，刘立思△

(1.华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉-头颈外科，湖北 武汉 430030;2.咸宁学院附属第一医院耳鼻咽喉科，湖北 咸宁 437100;3.浙江大学附属第一医院耳鼻咽喉科，浙江 杭州 310003)

外周性感音神经性聋是一种严重影响人类生活质量的疾病，其病因主要是由于耳蜗毛细胞的损伤引起，而毛细胞在成年哺乳动物不可自行再生。针对毛细胞再生的治疗方式包括基因治疗和细胞替换治疗。基因治疗可用于保护毛细胞[1]或产生新的毛细胞[2]，细胞替换治疗是利用干细胞产生新的毛细胞和听神经。不管是基因治疗还是细胞替换治疗，经耳蜗行局部显微注射，将基因和细胞导入耳蜗是最有效的方式。本课题组前期研究发现经大鼠圆窗导入绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)标记的神经干细胞后，可以在前庭阶和鼓阶发现GFP的表达，但在血管纹和Corti器无明显绿色荧光表达[3-4]。如何将外源性基因或细胞导入耳蜗Corti器部位，从而更好地发挥针对Corti器损伤的治疗作用。本实验以此为出发点，通过大鼠耳后切开手术进路，经耳蜗中阶侧壁显微注射携带增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein，EGFP)的慢病毒，并观察其在耳蜗的表达情况，为后续的经耳蜗中阶导入以慢病毒为载体的基因治疗提供实验基础。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 携带EGFP的慢病毒购于上海比昂公司，病毒滴度为2×108TU/m L。人工内淋巴液参照文献[5]配置，NaCl 1 m M ，KCl 126 m M ，KHCO325 m M ，M gCl20.025 mM ，CaCl20.025 m M，K2HPO41.4 m M。

1.2 动物分组 健康SD大鼠12只，雄性，体质量250～300 g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，耳廓反射正常，听性脑干反应(auditory brainstem response，ABR)检查示双耳听力正常。将大鼠随机分为两组:实验组6只，经耳蜗中阶侧壁行EGFP慢病毒显微注射;对照组6只，经耳蜗中阶侧壁行人工内淋巴液显微注射。

1.3 动物手术 大鼠用氯胺酮(40 mg/kg)和氯丙嗪(15 mg/kg)行大腿肌肉注射麻醉后，取头上脚下位侧俯卧于自制加热平板上并维持温度在37℃左右，头偏右侧使左耳向上。行耳后备皮后，碘伏消毒，手术器械术前经高温灭菌消毒。沿耳廓后沟2 mm处4点到7点的位置弧形剪开皮肤及皮下组织，向下分离腺体后剪开颈阔肌，用自制拉钩拉开切口，向深处钝性分离可见胸锁乳突肌，向上牵开胸锁乳突肌后，可见面神经和二腹肌后腹(封2图1a);向后分离并牵开二腹肌后腹，在面神经和二腹肌围成的三角区域内向深处分离并去除听泡外侧壁覆盖的软组织和筋膜，可暴露听泡外侧壁(封2图1b);沿听泡后外侧磨除骨壁并扩大，可暴露镫骨动脉、圆窗龛、耳蜗外侧壁(封2图1c);在耳蜗底周外侧壁色素沉着区，尽量远离镫骨动脉和便于操作处确定开孔口，用三棱针穿破耳蜗中阶外侧壁骨质，再用细坞针穿破内壁软组织膜，可见少许血液和清亮的淋巴液流出，将微量操纵器上固定的玻璃微电极导入开孔口，用5 min将EGFP慢病毒或人工内淋巴液5μL缓慢注入耳蜗中阶(封2图1d);完成后以自体小块颈阔肌覆盖，再用牙科水门汀覆盖颈阔肌，封闭耳蜗开孔口，行中耳腔碘伏清洗消毒后，用少许明胶海绵填塞中耳腔;复位肌肉和软组织，分层缝合切口。缝合口处以乙醇消毒。待大鼠清醒后，回笼中喂养。术后肌注青霉素20万IU/d，连续3 d。

1.4 ABR检测 于动物手术前和手术后3周在动物处死前行ABR测试。采用Nicolet Compass系统，刺激声为短声，时程0.1 ms，重复率为 11.1次/秒，滤波带宽 150～2000 Hz，叠加1000次，扫描周期10 ms。采用银丝电极，正极插入头顶正中皮下，参考电极插入检测耳颌面部皮下，地极电极插入对侧耳颌面部皮下。刺激声经插入式耳塞给入，给声策略采用升10降5法;以Ⅲ波消失的刺激强度确定阈值，并要求至少能重复1次。

1.5 标本取材和制备 术后3周，待ABR检测完后，将两组大鼠断头立即取出耳蜗，挑开蜗尖、前庭窗和蜗窗，从蜗尖灌注4%多聚甲醛至无血性物流出，并在4%多聚甲醛中4℃下固定过夜，再以20%EDTA脱钙2周后，20%蔗糖脱水，OCT包埋，沿蜗轴水平行冰冻切片。整个过程注意避光操作。

1.6 荧光显微镜观察 切片以PBS洗3遍，20%甘油封片，在荧光显微镜下观察、拍照。

1.7 统计学方法 全部数据经SPSS16.0统计软件处理，结果以表示。ABR阈值比较采用配对 t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠的一般情况 两组术中、术后均无动物死亡。术后大鼠无明显歪头、斜颈、行走不稳、面瘫、食欲减退及切口感染等症状。术后3周手术耳听泡打开后未见化脓感染，明胶海绵有少量残余，耳蜗开窗处可见白色的牙科水门汀封闭，未见明显异常。

2.2 ABR阈值的变化 手术后实验组大鼠的手术耳ABR阈值提高(55.8±4.9)dB SPL;对照组大鼠的手术耳ABR阈值提高(56.7±6.1)d B SPL;两组大鼠手术耳的ABR阈值比较差异无统计学意义(P＞0.05);两组大鼠的非手术耳在手术前、后ABR阈值无明显变化;两组大鼠的手术耳，在手术后听力均高于手术前，且差异有统计学意义(表1)。

表1 两组大鼠手术前、后ABR(click)阈值(dB SPL)

2.3 耳蜗内EGFP慢病毒的表达 在荧光显微镜下可见，术后3周实验组可见耳蜗内有EGFP的绿色荧光表达，其主要位于耳蜗中阶的血管纹边缘细胞、Corti器、螺旋神经和螺旋神经节细胞等部位;对照组的耳蜗内无EGFP的绿色荧光表达(封2图 2)。

3 讨 论

在外周性感音神经性聋动物模型的活体实验中，如何经耳蜗快速成功地导入基因或细胞是实验的关键。大鼠由于其基因组与人类的同源基因组相似，成为进行内耳研究的常用对象[6]。另外大鼠的手术耐受性和抗感染能力均强于小鼠，故本实验选取大鼠为研究对象。大鼠麻醉对手术的顺利进行显得很重要，氯胺酮和氯丙嗪的复合麻醉可以维持2 h左右，药量不可过大，否则可致动物死亡。

在耳蜗基因导入手术的进路选择上，国内外较多应用的是腹侧[7-8]和耳后[9]进路。大鼠听泡的位置较深，腹侧进路须经过气管、大的面静脉和颈动脉分支等结构，损伤后均可导致动物术中、术后发生死亡;而耳后进路经过的重要结构相对较少。本研究采取耳后进路，术中随时以手指探触骨性听泡的位置，切开颈阔肌，向上牵拉胸锁乳突肌，然后以面神经和二腹肌后腹围成的三角为解剖标志，即面神经下方、二腹肌后腹的前方，进一步向深处分离骨性组织上覆着的软组织和筋膜，即可暴露听泡;在听泡的前方有颈内动脉，操作时切勿靠前损伤而导致动物死亡。听泡开窗时位置选择靠前外，可避免损伤耳蜗侧壁和镫骨动脉，开窗的大小以能看见耳蜗底周骨质和镫骨动脉为宜，不宜过大。韩朝和迟放鲁[8]报道听泡打孔的位置选择在听泡下壁的前偏外侧，与作者观点一致。

在耳蜗中阶外侧壁开孔口的定位上，作者发现血管纹在耳蜗侧壁上呈现一较明显的色素沉着区，遂以耳蜗底周外侧壁色素沉着区为解剖标志带，选取尽量远离镫骨动脉且便于操作处为开孔口，在显微镜下将EGFP慢病毒导入耳蜗中阶。Iguchi等[10]报道通过观察耳蜗骨壁色素沉着区，在该部位开孔可将细胞导入内淋巴系统，这与作者的观点一致。本实验采用的EGFP是一种优化的突变型GFP，将64位丝氨酸用苏氨酸代替，65位苯丙氨酸用亮氨酸代替，使其产生的荧光比野生型GFP强35倍，大大增强了报告分子的灵敏度，该分子的激发波长为488 nm，发射波长为507 nm。经中阶导入后，可以发现在血管纹边缘细胞、Corti器、螺旋神经和螺旋神经节细胞等部位有EGFP的绿色荧光表达，提示可以通过慢病毒为载体，将外源基因导入到Corti器部位，更好地发挥针对Corti器损伤的基因治疗。韩朝等[11]报道经圆窗入路导入的腺病毒不能感染内外毛细胞和支持细胞;经耳蜗中阶侧壁导入的腺病毒，可以感染听器的支持细胞和血管纹缘细胞。

耳蜗侧壁开孔后，对大鼠听功能产生一定的影响。本研究发现手术前、后实验组大鼠 ABR阈值提高了(55.8±4.9)d B。Bogaerts等[12]报道CBA/CaH小鼠耳蜗侧壁开孔术后3个月ABR阈值提高了15～45 dB，并认为听力损失与开孔口的大小有关，小的开孔口导致小量的听力损失，大的开孔口导致大量的听力损失和术后转圈行为。Iguchi等[10]报道C57BL/6小鼠耳蜗侧壁开孔术后听力损失40～70 dB，而外半规管开孔导致的听力损失小于耳蜗侧壁开孔。韩朝等[13]报道通过豚鼠耳蜗中阶输注腺病毒后，ABR阈值为(33.33±11.69)dB。作者发现经耳蜗中阶外侧壁导入慢病毒和人工内淋巴的大鼠，术后ABR阈值无明显差异，提示ABR的阈值增高与导入内淋巴的物质无关，可能与手术和显微注射的过程有关;韩朝等[13]也报道向豚鼠耳蜗中阶输注的不同药物成分对其听力造成的影响在2周时无差别，听力损害只与灌注的机械性损伤有关。作者认为耳蜗开孔口尽可能的小，中耳操作时尽量不损伤听小骨、鼓膜、镫骨动脉等重要结构，可最大限度地减少手术过程造成的听力损失;选用可缓慢、匀速控制的显微注射系统可最大限度地减少显微注射过程造成的听力损失。对于如何既能将基因导入耳蜗中阶、又能尽量减小听功能的损伤还有待进一步的研究。

综上所述，本实验描述了一种安全、有效地将基因导入大鼠耳蜗中阶的方法，导入的外源性基因可以在耳蜗中阶的C roti器表达，为后续针对性地经耳蜗中阶导入治疗基因，治疗Corti器损伤的外周性感音神经性聋提供了实验基础。

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