德国牧羊犬精液冷冻保存的研究

黄 贺，赵 骞

（东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030）

德国牧羊犬以其威武凶悍、训练有素及“天然警犬”而著称于世。目前，我国已建立起德国牧羊犬的繁殖体系，从保存、繁育、使用情况来看，完全适应了公安、部队及国防建设的需要[1]。早在1780年，意大利生理学家Spallannani第一次用犬进行了AI试验[2]。Seager首次报道了犬的冻精AI获得成功[3]，之后相继建立了有关精液品质、冷冻及AI的一系列参数[4]。武石昌敬等也曾报道了犬冷冻精液AI[5]。潘寿文等首先对德国牧羊犬进行精液冷冻和AI进行研究并获得成功[6]，受胎率为22%，平均窝产仔数2条，王力波等对德国牧羊犬的精液冷冻研究也获得成功，受胎率和产仔数有所提高[7]。为了提高种公犬的配种效能、延长精液保存时间、提高牧犬受胎率和窝产仔数，本研究对牧羊犬的精液进行冷冻保存研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物

从黑龙江省哈尔滨市天尚犬舍选择圈养的雄性牧羊犬4条，体重15～25 kg，年龄2～5岁。饲料为配合日粮，每日散放运动，自由饮水。

1.2 方法

1.2.1 稀释液和冻精剂型对犬精冻后活率影响

本研究以冻精解冻后的活率作为评定标准，比较4种稀释液（见表1）和两种冻精剂型（0.1 mL颗粒、0.5 mL细管）牧羊犬精液冷冻复苏后的活率，从而筛选出最佳稀释液配方和冻精剂型。为减少试验组间差异，在进行四种稀释液和两种精液冷冻剂型对犬精液冻后活率的影响的研究时，将4只公犬的精液进行混合处理[5-6]。试验采用两因子有重复交叉分组设计，重复10次。

表1 四种稀释液配方Table 1 Formulations of four kinds of dilution

1.2.2 精液冷冻

分别采集4只公犬的精液各40次，进行品质检查后，分别离心（1 000 r·min-1，5 min）弃去精清，加37℃稀释液稀释至与离心前等量，封口后，先在离心管外缠数层纱布，然后外面再缠塑料袋并封口，放入4℃的冰箱，平衡4 h，取出，加入与精液等量的4℃稀释液，4℃冰箱内放置30 min。

（1）细管剂型的精液采用程序冷冻法：

（2）颗粒剂型的精液采用炸熏冷冻法：

将0.1 mL精液直接滴入液氮中，静置5～8 s取出后，再用液氮熏蒸8 min。

精液解冻采取温水解冻的方式，将冻精从液氮中取出，立即投入40℃水浴10 s，检查活率。

2 结果与分析

2.1 不同犬精液指标的比较

4只公犬的精液指标表明（见表2），4只公犬的射精量、精子活率和精子密度均达到正常标准，且组间差异均不显著，可以排除个体间差异对试验结果的影响。

表2 4只公犬的精液指标Table 2 Semen index of four male dogs

2.2 不同稀释液和冻精剂型对犬精液冻后活率影响的检测结果

四种稀释液和两种精液冷冻剂型的试验结果见表3。在稀释液2中，颗粒冻精的解冻后活率（0.44±0.02）显著高于稀释液 1（0.36±0.01）、稀释液3（0.37±0.02）和稀释液 4（0.30±0.03）（P＜0.05），稀释液1、稀释液3和稀释液4间差异不显著（P＞0.05）；颗粒冻精和细管冻精之间差异显著（P＜0.05），说明采用稀释液2配方和炸熏法冷冻精液时，颗粒冻精可获得较高活率。

表3 四种稀释液和两种精液冷冻剂型对犬精液冻后活率影响的检测结果Table 3 Effect to the sperm motility of four kinds of dilution and two kinds of semen frozen formulations

2.3 不同冷冻方式对犬冻精活率影响的检测结果

对四只公犬的精液进行炸熏法和程序冷冻法冷冻，炸熏法冷冻的精液冻后活率显著高于程序冷冻法冷冻的精液，说明德国牧羊犬的精液采用炸熏法可获得较高的冻后活率。试验结果表明，炸熏法的冷冻效果明显优于程序程序冷冻法（见表4）。

表4 不同冷冻方式对犬精液冻后活率的影响Table 4 Effect to the sperm motility of frozen semen of different ways in dogs

3 讨论

3.1 犬精液的冷冻方式

冷冻精液的实质是精液与周围的冷源环境进行能量交换的过程，精液在冷冻过程中释放出一定的能量后，便由液相变为固相[9]。在这个过程中，对精子有害温度区为0～60℃的冰晶化温度区。因为降温速率与精子的冻后活率和细胞结构完整性存在高度的相关性，降温过快会在细胞内形成冰结晶而导致精子死亡和细胞结构受损，而降温过慢则会因细胞外的溶质浓度升高，pH升高而导致精子死亡[10]。此外，由于在相同冷冻条件下不同稀释液的渗透压及pH变化幅度不同，因此，不同的冷冻液对冷冻的程序要求不同。禹学礼等建立了犬精液冷冻的炸熏法，与氟板法相比，冻后活率明显提高（P＜0.01）[8]。本试验是在国内外同类研究的基础上，对犬颗粒精液和细管精液的冷冻方式进行的初步研究，结果表明炸熏法的冷冻效果明显优于程序冷冻法。

3.2 犬精液的冷冻剂型

犬精液的剂型主要有颗粒、细管和安瓿三种，各有优劣，不同研究者观点也不一致。Olar等认为细管精液易于标记、贮存和解冻，比颗粒和安瓿精液更实用[11]，Seager等认为，颗粒冻精应该被细管和安瓿精液所取代[3]。潘寿文等认为，从生产的角度，安瓿剂型优于颗粒[6]。禹学礼的研究结果表明，颗粒冻精的冻后活率显著高于细管和安瓿（P＜0.01）[8]。在颗粒和细管两种剂型中，虽然单个颗粒冻精内的有效精子数少，但颗粒冷冻方便、冻后活率高、精液利用率高，输精时，只要将数个或十数个颗粒解冻后收集起来使用，既可克服其有效精子不足的弱点，又提高了精液的利用率。因此颗粒冻精更值得在犬的精液冷冻和AI中得到推广和应用。

4 结论

采用卵黄-Tris为主的稀释液2，应用颗粒炸熏法对犬的精液进行冷冻保存效果明显优于细管程序冷冻；在同一种稀释液中颗粒冻精的冻后活率高于细管冻精。

[1]王宪龙,刘彦,曾申明.国外犬精液冷冻技术的研究进展[J].中国畜牧杂志,2008,15(2)∶12-16.

[2]张忠诚.动物繁殖学[M].北京∶中国农业出版社,2004.

[3]Seager.Storage of boar semen[J].AI Digest,1969,27(3)∶6.

[4]Seager.Relation of semen quality tosperm transport,fertilization and embryo quality in ruminants[J].Reprod J Fertil,1975,45∶189-192.

[5]武石昌敬.犬的人工授精技术[J].家畜繁殖学杂志,1976,22(1)∶28-32.

[6]潘寿文,刘湖,马大君.犬的精液冷冻技术[J].畜牧与兽医,1986,2(3)∶105-106.

[7]王力波,杨殿军,周向阳,等.犬精液冷冻及人工授精的研究[J].黑龙江畜牧兽医,1991(5)∶35-36.

[8]禹学礼,庞有志,栗颖华,等.炸熏法冷冻犬精液的试验[J].中国兽医学报,1997(3)∶289-291.

[9]赵祥杰,李玉田,孙爽,等.精液颗粒冷冻技术的研究[J].东北农业大学学报,2008,39(3)∶70-75.

[10]Lian Z X,Li W.Biological effects of deer semen on development of testes in mice[J].Journal of Northeast Agricultural University∶English Editon,1997,4(1)∶52-54.

[11]Olar,Bowen,Pickett.Influence of extender,cryoperservative and seminal proccessing procedures on postthaw motility of canine spermatozoa frozen in straws[J].Theriogenology,1989,31(2)∶451.

*赵骞为本文的同等贡献者。