产芳香物质益生菌筛选及其对谷物食品发酵效果的研究

王青竹，高学军，卢志勇，骆超超，刘晓飞，于 微，李学琳

（乳品科学教育部重点实验室，东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）

随着我国国民经济的增长，人民生活水平的提高，广大消费者对饮食结构也有了新的更高的要求[1-2]。人们选择饮食时不仅考虑能满足营养的需求，同时也越来越考虑其风味、保健、治疗效果[3]。在生产面包、粮食饮料及米酒等谷物发酵食品时，将有某些特性的益生菌加入其中，或是提高其营养价值，或是改良其风味，则将会生产出适合人们对其要求越来越高的饮食物品。近年来微生物产香由于更天然健康所以倍受关注[4]，Jean等研究发现微生物通过酶水解机制影响酿酒的芳香物质释放[5]，许多学者对谷物发酵食品的产香进行了相关研究，刘信中等人通过对啤酒芳香性物质的气相色谱质谱分析发现了其中包含乙醇、2-苯乙醇和乙酸异戊酯[6-7]，陈妙兰等通过对白酒的芳香性物质的气相色谱质谱分析发现了其中包含乙醇、2-苯乙醇、3-羟基2-丁酮、冰乙酸、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯和壬酸乙酯[8-10]，杨秀琴等通过对酸面团的芳香性物质进行气相色谱质谱分析发现了其中包含乙醇、2-苯乙醇、3-羟基2-丁酮、甲酸丙酯和壬酸乙酯[11]。通过上述学者研究发现醇类和酯类对谷物发酵产品的芳香性有很大影响。

本试验从谷物食品中筛选出66种菌种及实验室保存的12种菌种，通过气相色谱分析、PCR鉴定及Blast分析，最后选择其中3种分别产芳香性物质乙醇、2-苯乙醇、甲酸丙酯最多的益生菌种，分别加到用面粉发酵馒头、用玉米粉发酵发糕及制造饮料、用糯米粉发酵粘豆包及发酵饮料的过程中，以期在增加它们的风味方面有所改进，从而生产出更适应人们需求的具有良好风味性的新型馒头、发糕、粘豆包、玉米饮料及大米乳酸饮料等食品。

1 材料与方法

1.1 材料

大列巴、馒头、发面饼、麻花、白酒酒曲、米酒、玉米面、面粉、糯米（以上均为哈尔滨市食品市场地产产品）和本实验室已有的12种菌株1.1625、1.0625、1.1086、1.9201、200402、200204、10.0353、10.0357、1.2471、1.2467、1.1482、1.29。

1.2 仪器与试剂

仪器：岛津公司GC-14C气相色谱仪、DM-inertwax 30 m×0.25 mm，ID 0.25 μm 气相色谱柱、SHG-300高纯氢发生器、SGK-2LB低噪音空气泵、DH6000A型电热恒温培养箱、SPX-250C型恒温恒湿箱、TDL-5000B冷冻离心机。

试剂：乙醇（Ethanol）、3-羟基2-丁酮（3-Hydroxy-2-Butanone）、甲酸丙酯（Propyl Formate）、乙酸苯乙酯（Phenylethyl Acetate）、乙酸甲酯（以上均为色谱纯）、乙酸乙酯（Ethyl Acetate）、壬酸乙酯（Ethyl Nonanoate）、冰乙酸（Acetic Acid）（以上均为分析纯）、糖化酶、淀粉酶。

1.3 菌种筛选

1.3.1 试验方法

将面包、麻花、馒头、发面饼、大列巴、粘豆包等发酵谷物的生面团、白酒曲和米酒通过微生物培养分离，获取单一菌种保存，将分离出的66种菌株和实验室保存的12种菌株接入液态培养基，培养12 h，离心取上清，上清液滤膜过滤后取2 μL样品直接用气相色谱仪进行检测。

1.3.2 色谱检测结果

气相色谱选用M-inertwax 30 m×0.25 mm，ID 0.25 μm气相色谱柱，在摸索好的条件下确定芳香物质的保留时间，得出标准曲线，然后对每个菌种进行检测，每个样品重复3次，最终测定含量。

1.3.3 菌种的鉴定

通过气相色谱的检测筛选出了1.0625、1.1086、1.2467、B3、B7、B9等6株菌种，然后通过初步镜检、糖发酵试验确定菌种类型，然后利用16rDNA、18SrDNA鉴定及blast分析、特异性引物PCR等技术鉴定，鉴定结果为：AS 1.2467（嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus，GenBank：EU483 105.1）、AS1.0625（保加利亚乳杆菌 Lacbobacillus bulgaricus， GenBank:AB494733.1）、 AS1.1086（纳豆芽孢杆菌Bacillus natto，GenBank:GU826165.1）、B7（酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae，GenBank：AY251636.1）、B3（克鲁斯假丝酵母 Candida krusei，GenBank：M55528.1）、B9（东方伊萨酵母 Issatchenkia orientalis，GenBank：DQ438180.1）。

最后通过相关文献的查阅，得出结论有三株菌株适合应用到食品当中，即为1.2467号菌嗜酸乳杆菌、1.0625号菌保加利亚乳杆菌、B7号菌酿酒酵母。

1.4 发酵试验

1.4.1 发酵馒头、发糕和粘豆包

材料：面粉600 g、水300 mL。

做法：将所有面粉加入水300 mL混合成团，将面团均分为4组小面团，每个小面团再分为3个平行。第一组小面团为对照面团，第二组小面团接入嗜酸乳杆菌1 mL，第三组小面团接入保加利亚乳杆菌1 mL，第四组小面团接入酿酒酵母1 mL，将面团分别揉至有筋度，面团表皮光滑为止（约揉5～10 min）。将面团分别放在大碗中，覆盖保鲜膜等它发酵至两倍大，约45～50 min（天气冷时发酵时间会延长）。发糕和粘豆包的制作方式如上，分别得到发糕面团1～4组和粘豆包面团1～4组，每组均有3个平行。等发糕和粘豆包面团发好后，每个面团做成大小均匀的馒头上屉蒸，大约15 min。所得四组发酵产品从视觉、嗅觉、味觉三个感官角度进行评定，最后得出结论。

1.4.2 玉米面制作玉米饮料[12]

称取等量的适量玉米面4份，编为四组，每组分3个平行，每个平行80 g玉米面，按1：2比例加水，200 U·g-1单位加入糖化酶，在121℃条件下灭菌20 min，即为玉米发酵料。第一组接种为空白组，第二组接种嗜酸乳杆菌，第三组接种保加利亚乳杆菌，第四组接种酿酒酵母，接种量均为0.3%～0.5%。发酵温度43℃、发酵时间20 h。发酵完后就四组产品的特征香气、口感、酒香、甜酸比、综合风味打分比较[13]。

1.4.3 糯米制作糯米饮料[14]

糯米饮料制作方法如下：将大米分成4份120℃蒸汽杀菌10 min，编为4组，每组分为3个平行，每个平行大米30 g，水200 mL。第一组空白对照组接入淀粉酶，第二组接入嗜酸乳杆菌和淀粉酶，第三组接入保加利亚乳杆菌和淀粉酶，第四组接入酿酒酵母和淀粉酶，菌种接入量均为0.3%～0.5%、淀粉酶0.05%～0.2%，在30℃培养15 h。发酵完后就四组产品的特征香气、口感、酒香、甜酸比、综合风味打分比较。以上试验经由50人品尝，从视觉、嗅觉、味觉等多个角度进行感官评定，以问卷调查的形式得出最终结果。

2 结果与分析

2.1 产芳香复制益生菌的筛选

结果见表1。

筛选出了 1.0625、1.1086、1.2467、B3、B7、B9等6株菌种，然后通过通用引物PCR、Blast分析及特异性引物PCR的鉴定，通过相关文献的查阅，得出结论有3株菌株适合应用到食品当中，即为1.2467号菌嗜酸乳杆菌（1.2467）、1.0625号菌保加利亚乳杆菌（1.0625）、B7号菌酿酒酵母（2.1427）。其中1.2467号菌种产2-苯乙醇量最高，1.0625菌种产甲酸丙酯量最高，B7菌种产乙醇量最高。

表1 筛选出的菌株通过气相色谱检测所得芳香物质的含量Table1 Content of aromatic substances of selected strains by gas chromatography （mg·L-1）n=3

2.2 发酵结果

2.2.1 面粉发酵馒头、玉米粉发酵发糕、糯米粉发酵粘豆包的感官评定

酿酒酵母产品口感稍甜、气味醇香更适合发酵馒头、发糕。在发酵馒头、发糕、粘豆包时产品味觉偏酸，但产香效果良好适合与其他菌种混合发酵，以提高产香效果。嗜酸乳杆菌发酵馒头、发糕、粘豆包等产品口味偏酸，香味不是十分明显，故不适合发酵以上产品。结果见表2～4。

表2 不同菌种发酵馒头的感官评定Table2 Sensory evaluation of bread fermented by different bacterium

表3 不同菌种发酵发糕的感官评定Table3 Sensory evaluation of steamed sponge cake fermented by different bacterium

表4 不同菌种发酵粘豆包的感官评定Table4 Sensory evaluation of rice cake fermented by different bacterium

2.2.2 玉米面制作玉米饮料、糯米制作糯米饮料的感官评定

由表5、6可知，嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌发酵产品口感微酸、气味具有独特米香，故发酵糯米和玉米酸性饮料比较适合，酿酒酵母发酵产品酒香味较浓郁，故发酵糯米和玉米酒精饮料比较适合。

表5 不同菌种发酵玉米饮料的感官评定Table5 Sensory evaluation of corn drink fermented by different bacterium

表6 不同菌种发酵糯米饮料的感官评定Table6 Sensory evaluation of sticky rice drink fermented by different bacterium

3 讨论与结论

人类对食品的获取，不仅是身体上的一种需求，也是心理上的一种享受。具有良好或独特风味的食品，会使人们在心里上、感官上得到真正的满足，并直接影响其对营养物的消化和吸收。在对发酵谷物中的菌种研究发现酸面团面包的产香与酵母和乳酸菌有很大关系，通过乳酸菌发酵可提高糯米饮料[15]和玉米饮料的品质和香味[16]，Dung等通过研究发现用多种酵母菌和霉菌发酵紫色糯米酿制的米酒具有独特的芳香性[17]，酵母在发酵波尔多葡萄酒过程中对它的香气也有很大影响[18]，乳酸菌对保加利亚当地的酒精性饮料boza风味也有调节作用[19]，作为北方特色传统食品的粘豆包也可以通过对其中益生菌的调控达到改善其感官品质的目的[20]。

本试验从谷物食品中筛选出66种菌种及实验室保存的12种菌种，通过气相色谱分析、PCR鉴定及Blast分析，最后选其中3种分别产芳香性物质乙醇、2-苯乙醇、甲酸丙酯最多的益生菌种分别为酿酒酵母、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌，我们用这三种菌种分别发酵馒头、发糕、粘豆包和谷物乳酸饮料，发现酿酒酵母适合发酵面食和发酵酒精性饮料，保加利亚乳杆菌适合面食增香和发酵谷物酸性饮料，嗜酸乳杆菌适合发酵谷物酸性饮料。

现在大部分的研究集中在对发酵食品产芳香物质的气相色谱质谱分析和从感官判定益生菌对发酵食品产香的影响，本实验通过气相色谱对芳香性物质的检测，从菌种产芳香性物质多少的角度入手，选择了产芳香性物质较多的酿酒酵母、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌3种菌，再用这3种菌分别发酵不同种的发酵食品，从中选择出最适合不同种发酵食品发酵的对应菌种，从而达到使发酵食品增香的目的，最终得到产香性能优良的产品。在用酿酒酵母发酵馒头、发糕和粘豆包的过程中发现发酵产品口感微甜，气味醇香较适合发酵面食，保加利亚乳杆菌在发酵过程中气味醇香，但发酵产品微酸，如果发酵面食需要在配方做出调整，嗜酸乳杆菌在发酵过程中口味偏酸，气味也无突出效果，故不太适合发酵面食。嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌发酵谷物饮料所得产品口感微酸、有米香味，适合发酵谷物酸性饮料。如果添加适量的糖进行调节，效果会更好。酿酒酵母发酵谷物饮料所得产品有酒香味，适合发酵酒精性饮料。

有报道单一的菌种发酵不能使发酵食品达到最佳效果，将乳酸菌和酵母按比例混合对发酵面食增香会有更好的效果[21]，保加利亚乳杆菌与嗜酸乳杆菌按比例混合对谷物发酵饮料也有更好的增香效果[22]，保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和酿酒酵母按比例组合添加到玉米发酵饮料中能产生独特的味[23]。通过菌种的特性按照不同比例组合会产生不同的效果，也更能适应不同种的谷物发酵食品的需求，今后我们应再开展复合菌种发酵的相关研究。

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