δ阿片受体激动剂对脓毒症大鼠肺组织细胞凋亡及肺组织Bcl-2、Caspase-3表达的影响

余欢明，冯文明，王耀

δ阿片受体激动剂对脓毒症大鼠肺组织细胞凋亡及肺组织Bcl-2、Caspase-3表达的影响

余欢明，冯文明，王耀

目的：观察δ阿片受体激动剂DADLE对脓毒症大鼠肺组织细胞凋亡及肺组织Bcl-2、Caspase-3表达的影响。方法：采用盲肠结扎加穿孔(CLP)法制作大鼠脓毒症模型，SD大鼠54只随机分为CLP组、DADLE组和假手术（SHAM）组。在不同时间点(12 h、36 h、72 h)处死大鼠，原位末端标记检测肺组织细胞凋亡情况，免疫组化法检测肺组织中Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的动态变化并比较肺组织的病理改变。结果：CLP组大鼠肺组织病理损害较SHAM组明显加重，DADLE组肺组织的病理变化明显减轻；CLP组大鼠肺组织细胞凋亡指数较SHAM组明显升高（P<0.01），以36 h组最明显（P<0.01）。结论：DADLE明显改善脓毒症大鼠肺组织的病理变化，可能与DADLE下调Caspase-3表达、上调Bcl-2表达，从而抑制肺组织细胞凋亡有关。

δ阿片受体激动剂；脓毒症；凋亡；Bcl-2；Caspase-3

研究表明，脓毒症时急性肺损伤时肺组织内大量细胞发生凋亡[1]。细胞凋亡受一系列基因的控制，其中Bcl-2基因是脓毒症后细胞凋亡关系最密切的凋亡调控基因之一[2]。本研究旨在通过动态观察δ阿片受体激动剂对脓毒症大鼠Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的影响，探讨δ阿片受体激动剂对脓毒症大鼠急性肺损伤保护的可能机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物清洁级雌雄不拘SD大鼠，体重190～210 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。1.2主要试剂D-丙2,D-亮5脑啡肽（[D-Ala2, D-Leu5]-enkephali，DADLE）由美国SIGMA公司提供。TUNEL试剂盒由德国Bochringer Mannheim公司提供。兔抗Bcl-2抗体、鼠抗Caspase-3抗体由美国Sant Cruz公司提供。SP免疫组化试剂盒由北京中山生物技术公司提供。

1.3 实验分组将54只SD大鼠（雌雄不拘）按随机数字表法分为3组：盲肠结扎加穿孔（CLP）组、DADLE组和假手术（SHAM）组各18只。根据不同时间点(12 h、36 h、72 h)又分为3个对应的亚组(n=6)。

1.4 模型制备按照常规方法行CLP，复制严重腹腔感染脓毒症模型。大鼠称重，编号，并禁食12 h，自由饮水。麻醉后固定，消毒，铺无菌巾。沿腹正中线切口，暴露盲肠并于根部结扎，用16号穿刺针贯通穿刺盲肠3次形成肠瘘，将盲肠还纳腹腔，逐层缝合切口。皮下注射10 mL生理盐水，术后自由饮水。SHAM组仅开腹，分离盲肠远端与大肠系膜后关腹，即除盲肠不结扎穿孔外，其余处理与各组保持一致。SHAM组及CLP组在手术前0.5 h分别给予10 mL/kg的生理盐水腹腔注射；DADLE组术前0.5 h分别给予10 mL/kg的DALDE腹腔注射（浓度为0.5 mg/mL）。于预定的时间点（12、36、72 h）断头处死存活大鼠。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 肺组织的病理组织学检查取肺组织约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，用10%甲醛液固定后，石蜡包埋，切片4～5μm厚，脱蜡后常规行HE染色。

1.5.2 原位末端标记法检测肺组织细胞凋亡采用TUNEL法检测，按试剂盒说明书操作：⑴固定包埋，切片；⑵脱蜡；⑶消化膜蛋白及核蛋白(20 mg/L蛋白酶K室温消化15 min，蒸馏水洗3次；3 mL/L甲醇双氧水室温下10 min，PBS洗5 min×3次)；⑷加TUNEL反应混合物,37℃，60 min，PBS中洗5 min×3次；⑸加入过氧化物酶连接的抗荧光抗体,37℃，30 min，PBS洗5 min×3次；⑹加入底物显色10 min；⑺苏木素复染、脱水、封片。细胞核中有棕褐色颗粒者为阳性细胞，计算5个高倍视野（×400）下的凋亡细胞数，以每百个细胞中的凋亡细胞数表示凋亡指数。

1.5.3 免疫组化检测肺组织的Bcl-2、Caspase-3蛋白表达兔抗Bcl-2抗体、鼠抗Caspase-3抗体稀释度均为1∶100。分别用等稀释度的兔抗及鼠抗IgG做阴性对照。切片依次二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，3%过氧化氢孵育10 min，三蒸水洗3次，每次5 min。PBS浸泡5 min,微波炉抗原修复15 min。自然冷却至室温。滴加羊封闭血清，室温孵育1 h，倾去勿洗。滴加1∶100的一抗（分别为Bcl-2或Caspase-3），放入4℃冰箱过夜。PBS冲洗3次，每次5 min，擦净切片周围水分后，滴加亲和素标记的二抗，室温孵育2 h，PBS冲洗3次，每次5 min，滴加辣根过氧化物酶标记链霉亲和素工作液，放入37℃温箱孵育20 min。PBS洗3次，每次5 min，DAB显色，脱水、透明、封片。切片采用LEICA Qwin图像处理与分析系统(Leica公司，德国)进行图像分析。每张切片取CA1区中1/3段测量平均灰度值，然后减去此片背景平均灰度值，取其相反数作为最终光密度值(OD)。Bcl-2和Caspase-3蛋白的免疫组化结果判断[3]：⑴阴性(-)，细胞浆内无染色；⑵阳性(+)，细胞内见黄色颗粒；⑶中等阳性(++)，细胞浆内见较深棕黄色颗粒；⑷强阳性(+++)，细胞内见大量深棕黄色颗粒。在显微镜下随机选择10个区域，每个区域统计100个细胞，将每个区域中Bcl-2、Caspase-3阳性的细胞数相加，即为Bcl-2、Caspase-3的阳性表达率。

2 结果

2.1 各组中死亡大鼠的处理本实验各组大鼠12 h前无死亡；12～36 h间CLP组死亡1只；36～72 h间CLP组死亡2只，DADLE组死亡1只。

2.2 肺脏的病理组织学观察光镜下见肺泡间隔增宽，炎症细胞渗出，以中性细胞和淋巴细胞为主，肺泡腔狭窄。36、72 h肺组织病理学改变加重，肺泡间隔明显充血、增宽，大量炎症细胞渗出，肺泡腔明显狭窄，有时可见肺实变。见图1、图2、图3。

图1 SHAM组大鼠肺组织病理学变化(HE×200)

2.3 大鼠肺细胞凋亡CLP组较SHAM组明显增加，36 h时最明显。DADLE组较SHAM组明显增加，但较CLP组明显降低。DADLE组内仍以36 h时段肺组织细胞凋亡指数最高。见表1。

2.4 肺组织Bcl-2、Caspase-3蛋白表达Bcl-2蛋白的表达率：CLP组各时间点较SHAM组明显降低，DADLE组较CLP组有明显增高，较SHAM组表达降低，Bcl-2表达与肺细胞凋亡情况负相关（r=-0.95）。Caspase-3蛋白的表达率：CLP组较SHAM组明显增高，DADLE组各时间点肺组织较CLP组有明显降低,较SHAM组增高。Caspase-3表达与肺组织细胞凋亡指数正相关（r=0.71）。见表2。

图2 CLP组不同时间大鼠肺组织病理学变化。2A：12 h(HE×200)；2B：36 h(HE×200)；2C：72 h(HE×200)

图3 DADLE组不同时间大鼠肺组织病理学变化。3A：12 h(HE×200)；3B：36 h(HE×200)；3C：72 h(HE×200)

表1 各组大鼠肺细胞凋亡指数变化±s)

表1 各组大鼠肺细胞凋亡指数变化±s)

注：与SHAM组相同时间点比较,*P<0.01;与CLP组相同时间点比较,#P<0.01;与同组12 h比较,ΔP<0.01;与同组36 h比较,▲P<0.01

时间组别SHAM组CLP组DADLE组12 h 0.87±0.52#▲（n=6）36.67±5.68*▲（n=6）28.03±3.49*#▲（n=6）36 h 0.83±0.34#Δ（n=6）44.67±4.01*Δ（n=5）36.50±4.51*#Δ（n=6）72 h 0.67±0.32#Δ▲（n=6）23.02±2.10*Δ▲（n=4）14.30±2.04*#Δ▲（n=5）

表2 各组大鼠肺组织Bcl-2、Caspase-3蛋白表达阳性率±s)

表2 各组大鼠肺组织Bcl-2、Caspase-3蛋白表达阳性率±s)

注：与SHAM组相同时间点比较,*P<0.01;与CLP组相同时间点比较,#P<0.01;与同组12 h比较,ΔP<0.01;与同组36 h比较,▲P<0.01

Caspase-3表达阳性率‰100.36±3.61#102.58±2.36# 99.21±5.27# 805.30±22.32*▲915.36±21.36*▲734.02±24.25*Δ▲588.78±18.36*#▲708.23±25.41*#Δ501.67±31.01*#Δ▲组别n SHAM组CLP组DADLE组12 h 36 h 72 h 12 h 36 h 72 h 12 h 36 h 72 h 6 6 6 6 5 4 6 6 5 Bcl-2表达阳性率‰890.37±45.12#915.56±30.36# 898.01±37.28# 583.32±23.02*▲406.67±24.36*▲635.02±37.23*Δ▲741.67±16.63*#▲646.25±36.32*#▲751.17±54.32*#▲

3 讨论

脓毒血症是引起急性肺损伤最常见的病因。在脓毒血症的发生发展中，肺脏作为一个重要的靶器官，急性肺损伤可能诱导多器官功能障碍甚至衰竭。细胞凋亡是在一定的生理病理条件下，为维持内环境或者器官组织构建的需要，由基因控制的细胞自主地有序地死亡。近年来的研究发现，创伤、感染、损伤后内毒素、炎症介质、氧自由基等都可诱导肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞的凋亡。脓毒血症肺组织细胞凋亡参与了肺功能损伤的发生发展，凋亡细胞包括肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞、血管内皮细胞和淋巴细胞，细胞凋亡在脓毒血症是引起急性肺损伤的可能作用为，血管内皮细胞和肺泡上皮细胞的凋亡导致血管壁和肺泡壁通透性增高，渗出增加，引起肺泡弥散功能下降；大量淋巴细胞凋亡导致机体免疫功能紊乱，影响了促炎抗炎反应的平衡，共刺激分子表达能力下降，细胞免疫功能下降。本研究中CLP组大鼠肺组织病理损害明显，早期肺泡间隔增宽，炎症细胞渗出，以中性细胞和淋巴细胞为主，肺泡腔狭窄。另外，本研究采用TUNEL法染色，原位检测细胞凋亡的客观指标，在制模后12 h肺组织细胞凋亡已显著高于SHAM组，36 h达到高峰，提示脓毒血症早期肺组织即可发生细胞凋亡。

诸多报道认为，肺组织细胞凋亡的发生与否受Fas/FasL、Bcl-2家族、Caspase家族等因素的调控[4]。Bcl-2蛋白是最重要的抗凋亡物质，在缺血一再灌注条件下，原癌基因Bcl-2激活起到重要内源性抑制凋亡作用。其机理是：⑴抑制凋亡蛋白酶Caspase的激活，阻止凋亡事件的发生；⑵直接的抗氧化作用；⑶抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质，如细胞色素C；⑷抑制促凋亡蛋白Bax、Bak的细胞毒作用。本研究表明，脓毒血症时肺组织Bcl-2蛋白的表达明显降低，但在DADLE处理后，其Bcl-2的表达较CLP组增加，与肺组织细胞凋亡呈负相关。脓毒血症时具有抗细胞凋亡的Bcl-2蛋白的活性受到抑制，从而诱导肺组织细胞凋亡。

Caspase是一类人冬氨酸特异性的半胧氨酸蛋白酶。已有的研究表明，Caspase-3的激活在肺组织细胞凋亡的发生中起重要的作用。Caspase-3是细胞凋亡的效应器，是细胞凋亡的下游关键酶和调控蛋白，也是Caspase级联反应中最关键的执行分子，当Caspase-3被激活，生成活化的Caspase-3 p17和p12亚基，对细胞凋亡的发生和调制发挥重要作用。诱导细胞凋亡实质上都是通过Caspase蛋白的次序激活而实现的，大多数触发细胞凋亡的因素，最终均需要通过Caspase-3介导的多种信号传导途径导致细胞凋亡。因此，Caspase-3是凋亡的最终执行者，在凋亡级联激活中处于核心地位。本研究发现，脓毒症后12 h肺组织Caspase-3即有大量表达，DADLE处理后其12 h、36 h及72 h时Caspase-3的表达均可以减少，且发现Caspase-3的表达与肺细胞凋亡成正相关。

目前，DADLE在移植心保护和休克治疗中均取得明显效果[5]。我们的研究证实，在DADLE处理后，脓毒症大鼠肺组织损害较对照组减轻，凋亡指数明显降低，同时证实Bcl-2的表达与肺组织细胞凋亡负相关，Caspase-3表达与肺组织细胞凋亡正相关。因此，我们推断，DADLE可以通过抑制Caspase-3的激活、同时降低了脓毒症时对Bcl-2活性的抑制作用，从而抑制肺组织细胞凋亡。

[1]徐笑益，方向明，鲍军明，等.脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织细胞凋亡的研究[J].全科医学临床与教育，2007，5(1):12.

[2]Park SE,Kim SH,Hossain MA.Korean red ginseng extract induc⁃es apoptosis and decreases telomerase activity in human leukemia cells[J].J Ethnophamacol,2008,7(11):3586.

[3]肖旭,梅广林,胡卫东,等.葛根素对大鼠肝缺血再灌注后Cas⁃pase-3和Bcl-2表达的影响[J].交通医学,2008，22(5):472.

[4]雷环成，王珏，余刚.马钱子碱中毒大鼠肺组织Bcl-2与Cas⁃pase-3蛋白的表达[J].郧阳医学院学报，2008，27（5）：426.

[5]Gross GJ.Role of opioids in acute and delayed preconditioning[J]. J Mol Cell Cardiol,2003，35(7):709.

（收稿：2009-12-20修回：2010-06-22）

（责任编辑刘洪斌田在善）

Effect of δ-opioid Receptor Agonists on Apoptosis of Pulmonary Tissue and Expression of Bcl-2 and Caspase-3 in Septic Rat

Yu Huanming,Feng Wenming,Wang Yao.Institute of Molecular Surgery,The First

People’s Hospital of Huzhou City,Zhejiang Province,Hozhou(313000),China.

ObjectiveTo observe the effects ofδ-opioid receptor agonists DADLE on apoptosis of pulmo⁃nary tissue and expression of Bcl-2 and Caspase-3 in septic rat.MethodsSepsis was reproduced in rats by cecum ligation and puncture(CLP).Fifty-four SD rats were randomly divided into CLP group,DADLE group and sham-operation(SHAM)group.The rats were respectively killed at different time(12 h,36 h and 72 h after operation).Pneumonocyte apoptosis was detected by TdT-mediated dUTP Nick End Labeling(TUNEL).The ex⁃pressions of Bcl-2 and Caspase-3 protein were detected by immunohistochemistry.ResultsThe pathologic changes in pathological lesin of rats in CLP group were obviously more seriously as compared with SHAM group, while it was improved obviously in DADLE group.The apoptosis index of rat pneumonocytes in CLP group signif⁃icantly increased as compared with SHAM group(P<0.01),and it was further prominent at 36h(P<0.01). Conclusion The findings indicate that δ-opioid receptor agonists DADLE can obviously improve pulmonary tis⁃sue pathological changes of septic rats,with the protective mechanism of downregulatiion of Caspase-3 expres⁃sion and upregulation of Bcl-2 expression,and thus to repress the apoptosis of pulmonary tissue.

δ-opioid receptor agonists,sepsis,apoptosis,Bcl-2,Caspase-3

Q95-33；R631

A

1007-6948(2010)05-0561-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2010.05.015

浙江省湖州市第一人民医院普外科，湖州市第一人民医院分子外科研究所（湖州313000）

余欢明，E-mail:aquamarine329@163.com