清营泻瘀方对肠缺血再灌注损伤大鼠肠屏障的保护作用

吴志明，陈江，储修峰，娄建平，孟兴成，邱海江

清营泻瘀方对肠缺血再灌注损伤大鼠肠屏障的保护作用

吴志明，陈江，储修峰，娄建平，孟兴成，邱海江

目的：探讨清营泻瘀方对肠缺血再灌注损伤大鼠肠屏障的保护作用及可能机制。方法：80只SD大鼠，随机分为假手术组（n＝8）、肠缺血再灌注模型组（n＝24）、清营泻瘀方治疗组（n＝24）和大承气方治疗组（n＝24），后3组按造模后处死时间的不同又分别分为术后2 h组、术后24 h组和术后48 h组，每组8只。采用夹闭肠系膜上动脉45 min的方法诱导肠缺血再灌注损伤模型，分别观察再灌注后2 h、24 h和48 h肠黏膜的病理改变以及血清中TNF-α、IL-10和血浆中D-乳酸的水平。结果：清营泻瘀方和大承气方都能够减轻肠黏膜的损伤，降低血中TNF-α和D-乳酸的含量（P<0.05），晚期降低IL-10水平（P<0.05）。清营泻瘀方在在保护肠黏膜和降低血D-乳酸的水平方面优于大承气方（P<0.05）。结论：清营泻瘀方对肠缺血再灌注损伤大鼠肠屏障有显著的保护作用，其可能机制与荡涤肠胃宿垢，减少细菌移位、调节炎症介质平衡有关。

肠缺血再灌注；清营泻瘀方；大承气方；肠屏障功能

目前研究表明，肠缺血再灌注损伤是严重创伤、休克和感染的发生中常见的病理生理过程，从而引起肠黏膜屏障损害，造成肠道细菌、内毒素移位，引起网状内皮系统发生系列反应，释放大量细胞因子和其它炎症介质，导致失控的炎症反应和脓毒症，是导致多器官功能障碍综合征（MODS）形成的主要原因。因此在防治创伤后脓毒症和MODS发生发展中，如何减轻肠缺血再灌注损伤，已经引起了国内外学者的普遍关注。

我们在临床实践发现，肠缺血再灌注损伤急性期以热邪和毒邪为主，表现为热毒炽盛,采用清营泻瘀方，清热解毒，凉血泻瘀，临床应用效果显著。本实验通过建立大鼠肠道缺血再灌注模型，研究肠道缺血再灌注损伤对肠黏膜结构和功能的影响,并与大承气方对比，研究清营泻瘀方对肠缺血再灌注大鼠肠屏障的保护作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物SD雄性大鼠80只，体重（280±10）g，清洁级，浙江大学医学院实验动物公司提供，清洁级动物房饲养，20～24℃，自由饮水，普通饲料喂养。1.2药物戊巴比妥钠购自美国Sigma公司。中药清营泻淤方：水牛角片30 g，益母草30 g，生大黄15 g（后下），芒硝12 g，党参15 g，甘草10 g；中药大承气方：生大黄12 g（后下），厚朴24 g，枳实12 g，芒硝6 g（冲）；采用配方颗粒制成浓度为1∶1药液(含生药1 g/mL),灭菌处理后4℃冰箱内保存。配方颗粒剂由江苏天阴药业有限公司提供（批号：0809168）。

1.3 主要试剂及仪器TNF-α和IL-10的试剂盒分由美国Biosouce International Inc和R＆D Systems Inc公司提供。D－乳酸试剂盒为美国Synthecon公司产品，D-乳酸脱氢酶(D-LDH)购于美国Sigma公司。芬兰Labsystems Dragon Wellscan MK2型酶标仪。

1.4 动物模型的制备用1%戊巴比妥钠(100 mg/kg)腹腔内注射麻醉，于上腹部正中切口（长约2 cm）入腹，分离肠系膜上动脉及其周围组织，在肠系膜上动脉根部用动脉夹钳夹，观察2 min。待确定肠系膜上动脉血流被阻断后（肠壁苍白，血管无搏动）缝合伤口，45 min后开腹，打开动脉夹，恢复肠系膜上动脉血液供应（肠壁变红，血管搏动），再关腹。整个手术过程中，于腹腔内滴加37℃生理盐水5 mL，保持血流动力学的稳定，并注意给大鼠保暖。

1.5 动物分组及给药方法将80只大鼠随机分为假手术组（8只）、模型组（24只）、清营泻瘀方治疗组即清泻组（24只）和大承气方治疗组即承气组（24只），后3组按造模后处死时间的不同又分别分为再灌注后2 h组、再灌注后24 h组和再灌注后48 h组（每组8只）。各组大鼠术前2 d，分别给予生理盐水、清营泻瘀方和大承气方灌胃（2.2 mL/只/d），最后一天灌胃在术前30 min。按组别分于再灌注后2 h、24 h和48 h处死动物，取末端回肠组织作病理切片，所采血样3 000 r，离心20 min，分离血清和血浆，置-70℃超低温冰箱中保存。

1.6 检测指标及其方法组织病理学:将回肠末端组织固定于中性福尔马林溶液中,常规脱水,石蜡包埋,切片HE染色后光镜下观察组织学变化。血清中TNF-α和IL-10的测定：采用酶标仪进行测定，试验严格按照试剂盒使用说明所规定的操作规程和结果判定方法进行。血浆D－乳酸的测定:血浆D-乳酸采用改良的酶学分光光度法检测。将血浆加入试管,与含4.6 mmol/L NAD+的碳酸盐缓冲液混合。待测管加入50 μL D-乳酸脱氢酶,空白管加入50 μL蒸馏水,以空白管调零于340 nm处测定吸光度[7]。

1.7 统计学分析所有数据均采用SPSS 10.0统计软件进行分析。计量资料以以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肠黏膜组织形态学观察肠黏膜病理采用Chiu评分，评分标准见表1，结果见表2。光镜下，假手术组回肠黏膜形态结构无明显变化；模型组肠I/R后2 h后呈急性炎症改变：黏膜和黏膜下层充血、水肿和糜烂，固有层有多量中性粒细胞浸润，部分可见黏膜上皮坏死脱落（图1）；清泻组和承气组亦可见上述表现，但损伤程度较模型组明显减轻（P< 0.01），清泻组优于承气组（P<0.05）（图2～图3）；肠I/R后24 h和48 h，各组肠黏膜结构基本修复，治疗组与模型组无明显差别,但同假手术组比较均有显著性差别（P<0.01）。

表1 肠黏膜损伤评分标准

表2 各组间大鼠肠黏膜Chiu评分±SD)

表2 各组间大鼠肠黏膜Chiu评分±SD)

注：与模型组相比较，**P<0.01；与承气组比较,◇P<0.05

组别假手术组模型组清泻组承气组n8 8 8 8再灌注2 h 0.63±0.52**4.13±0.83 2.38±0.52**◇3.13±0.64**再灌注24 h 0.63±0.52**2.13±0.64 1.75±0.71 1.88±0.64再灌注48 h 0.63±0.52**2.00±0.76 1.50±0.53 1.75±0.46

图1 模型组肠I/R后2 h（HE,×40）

图2 清泻组肠I/R后2 h（HE,×40）

图3 承气组肠I/R后2 h（HE,×40）

2.2 血清中TNF-α和IL-10含量的变化肠I/R后2 h，与假手术组相比，模型组血清中TNF-α水平明显升高，有显著性差别；清泻组和承气组TNF-α水平均较模型组均明显降低，差别有显著性；但IL-10的表达在各组间无差别。肠I/R后24 h，与假手术组相比，模型组血清中TNF-α和IL-10水平均明显升高，有显著性差别；清泻组TNF-α水平较模型组降低，差别有统计学意义；清泻组和承气组IL-10水平均较模型组明显降低，具有显著性差别。肠I/R后 48 h，治疗组与模型组无明显差别,但同假手术组比较均有显著性差别。见表3～表4。

表3 各组间大鼠血清TNF-α含量的比较±SD:pg/mL）

表3 各组间大鼠血清TNF-α含量的比较±SD:pg/mL）

注：与模型组相比较，**P<0.01；与承气组比较,◇P<0.05

组别假手术组模型组清泻组承气组n8 8 8 8再灌注2 h 90.77±4.41**143.21±18.19 104.17±6.40**107.10±11.82**再灌注24 h 90.77±4.41**114.88±13.73 102.83±13.90◇104.94±9.32再灌注48 h 90.77±4.41**110.50±7.64 105.08±6.88 105.69±6.56

表4 各组间大鼠血清IL-10含量含量的比较±SD:pg/mL）

表4 各组间大鼠血清IL-10含量含量的比较±SD:pg/mL）

注：与模型组相比较，*P<0.05，**P<0.01

组别假手术组模型组清泻组承气组n8 8 8 8再灌注2 h 16.14±4.22 19.93±6.40 17.35±2.89 17.39±3.44再灌注24 h 16.14±4.22** 49.04±13.17 22.83±8.31**27.90±13.22**再灌注48 h 16.14±4.22** 39.89±16.04 31.03±14.32 30.25±16.06

2.3 血浆中D－乳酸含量的变化D－乳酸是肠道细菌特有的代谢产物，进入机体后不参与代谢反应因此血浆中D－乳酸含量的变化可反映肠黏膜通透性的改变。肠I/R后2 h,与假手术组相比，模型组血浆中D－乳酸水平明显升高，有显著性差别；清泻组和承气组D－乳酸水平较模型组均明显降低，差别有显著性，清泻组优于承气组；肠I/R后24 h，与假手术组相比，模型组血浆中D－乳酸水平明显升高，有显著性差别；清泻组D－乳酸水平较模型组降低，差别有统计学意义；肠I/R后48 h，与假手术组相比，模型组血浆中D－乳酸水平依然明显升高，有显著性差别；清泻组和承气组D－乳酸水平较均模型组降低，差别有统计学意义，清泻组优于承气组。见表5。

表5 各组间大鼠血浆中D乳酸含量的比较±SD:mg/L）

表5 各组间大鼠血浆中D乳酸含量的比较±SD:mg/L）

注：与模型组相比较，*P<0.05,**P<0.01；与承气组比较,◇P<0.05

组别假手术组模型组清泻组承气组n8 8 8 8再灌注2 h 3.60±0.69** 14.13±2.09 10.38±1.41**◇11.95±1.37**再灌注24 h 3.60±0.69** 9.93±1.03 8.54±0.54*9.19±0.36再灌注48 h 3.60±0.69** 9.08±0.56 7.29±0.96**◇8.31±0.79*

3 讨论

中医认为，邪和瘀是诸血管病发生的主要原因，以邪为主因，由邪（致病因子）致瘀（血栓）继而伤正（缺血或郁血）[1]。因此邪盛致生新瘀则病急，邪祛但留旧瘀则病缓。尽管临床研究[2]发现活血化瘀类中药如丹参具有改善腹腔脏器的血液循环，防止血栓形成的作用，但是仅适用于慢性缺血阶段，如果不择时机，不辨病邪的全程重用，反可使疗效降低，病程延长。我们在临床实践发现，肠缺血再灌注损伤急性期以热邪和毒邪为主，表现为热毒炽盛，灼伤营血而生瘀，治疗上以清热解毒，凉血泻瘀为主，疗效显著。

清营泻瘀方是上海市名老中医奚九一教授的临床经验方剂，重用益母草、水牛角片作为清热凉血解毒之主药，具有清热解毒、凉血行瘀、利水消肿的功效。此外根据“六腑以通为用”，“胃气以降为顺”的原则，还着重使用了通腑泻下类药物大黄和芒硝，荡涤肠胃宿垢、致病菌和毒素，消除肠道麻痹造成的肠道瘀滞状态，使病人在最短的时间内排便、排气，减少肠道有害物质的吸收，减少肠道细菌移位；同时能够通过调节前列腺素I2(PGI2)与血栓素B2(TXB2)之间的平衡，保证组织器官的微循环，改善肠道组织血液灌流，降低毛细血管的通透性，维护肠道黏膜屏障的正常功能，从而降低血中内毒素水平，预防MODS的发生[3]。

TNF-α作为促炎介质中的首动因子及致炎损伤网络的中心环节，在肠缺血再灌注损伤中起着重要的作用，它可诱发IL-1、IL-6、IL-8、血小板活化因子（PAF）、前列腺素和白三烯等的分泌，由此产生炎症连锁反应，引起全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征。IL-10是一种有效的抗炎介质，可拮抗TNF-α，产生保护作用，但产生过多可引起免疫抑制。清营泻瘀方中益母草苦泄辛散，有利尿消肿，通畅水道的作用，使毒邪无以留置，大量的毒素及有害物质从水道排出；水牛角味苦性寒，能入血分，有清热解毒，凉血定惊之功，祛除热邪；两者合用拮抗炎性损伤，降低TNF-α和IL-10的表达，阻断炎症级联反应，提高机体的免疫功能。

D-乳酸是肠道固有细菌的代谢终产物，由于其他哺乳动物机体各组织既不能产生D-乳酸也没有快速代谢分解D-乳酸的酶系统，所以外周血D-乳酸主要来源于肠道，而其在肝内不被分解，故其水平可反映肠道机械屏障的功能状态。大多研究[4-5]表明，急性肠缺血引起的肠黏膜损伤可使血D-乳酸浓度迅速升高，并且D-乳酸含量与内毒素浓度呈显著正相关。清营泻瘀方通过荡涤肠胃宿垢、致病菌和毒素，降低炎症介质的含量而消除肠道瘀滞状态，减少肠道有害物质的吸收，减少肠道细菌移位，保护肠屏障功能，减少肠道细菌和内毒素移位。

肠缺血再灌注损伤是多种因素参与的复杂病理过程，而目前单一的药物治疗往往无法奏效，所以只有全面考虑，尽可能地打断多种环节的影响，才有可能取得突破性的进展。中药清营泻瘀方在临床和动物实验中显示出较好的疗效，但其应用方式、剂量、副作用及长期疗效尚不肯定，缺乏严谨的临床实验设计及大样本的对比研究，值得做进一步探讨。我们应在临床方面进行较大规模的前瞻、多中心研究，采用循证医学的方法对其保护肠缺血再灌注方面的最终疗效进行客观的评价，并进一步研制开发出更为有效的药物，从而为早期防治创伤后脓毒症和MODS的研究开辟新的途径。

[1]奚九一．因邪致瘀，祛邪为先－论脉管病的诊治思路与方法[J].上海中医药杂志，2001，35(6)：4.

[2]田伏州，尹致良，李小军，等．丹参对肠道屏障的保护作用机制研究[J].中华消化杂志，2000，20（6）：409.

[3]赵卫川，崔乃强，赵琪．承气合剂缺血再灌流肠管内毒素转运的影响[J].中国中西医结合外科杂志，1998，4（2）：83.

[4]柳勒龙，田晓峰，张雪梅，等．D-乳酸在急性肠缺血早期诊断中的价值[J]．中华实验外科杂志,2004,21（4）:497.

[5]吴彪,王春友.急性胰腺炎肠道屏障功能损伤时血浆内毒素D-乳酸的变化[J].中华普通外科杂志,2009,18(3):224.

（收稿：2009-12-10修回：2010-06-20）

（责任编辑刘洪斌田在善）

Protective effect of Qing Ying Xie Yu Fang（清营泻瘀方）on Gut Barrier Function on Intestine Isch⁃emia-Reperfusion Injury in Rats

Wu Zhiming,Chen Jiang,Chu Xiufeng,et al.Department of Surgery,Sha⁃

oxing County Central Hospital,Shaoxing(312030),China

ObjectiveTo study the effects and mechanism of Qing ying xie Yu Fang(QXF)（清营泻瘀方）in the protection of gut barrier function of intestinal ischemia-reperfusion in rats.Methods Eighty Sprague Dawley rats were randomly divided into sham(n=8),model(n=24),QXF(n=24)and Da cheng Qi Fang(CQF)(大承气方）(n=24)groups.The last three groups were respectively divided into 2 hour group,24 hour group and 48 hour group.Intestinal isxhemia-reperfusion model in rats was induced by clamping the superior mensenteric ar⁃tery for 45 minutes period.The pathologic injury of the intestine and the level of TNF-α,IL-10,D-lactic acid in blood were examined at 2 hour point,24 hour point and 48 hour point after reperfusion respectively.The sta⁃tistical analysis was finished with SPSS11.0 software.Results QXF and CQF both alleviated the pathologic in⁃jury of the intestine and reduced the levels of TNF-α,D-lactic acid(P,0.05)in the early period and IL-10(P< 0.05)in the late period.But QXF had better curative effects than CQF in reducing the level of D-lactic acid(P< 0.05).ConclusionQXF can reduce the gut injury of intestinal ischemia-reperfusion with the following possi⁃ble mechanism:to clear up dunghill in intestine,regulate the balance of inflammatory mediators and protect gut barrier function.

intestine ischemia-reperfusion inju⁃ry,Qing Ying Xie Yu Fang,Da Cheng Qi Fang,gut barrier function

Q95-33；R656.7

A

1007-6948(2010)05-0557-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2010.05.014

浙江省医学会临床科研基金项目（2009ZYC45）

浙江省绍兴县中心医院(中国医科大学绍兴医院）外科（绍兴312030）

吴志明，Tel：0575-85580858；E-mail：wuzhimingmedi@tom.com