人β防御素-2抗唾液支原体活性研究

王玉爱 刘志杰

β-防御素-2(hBD-2)是近年发现的一类由中性粒细胞和上皮细胞产生的，富含半胱氨酸的阳离子低分子肽类，它先天性免疫中保护宿主免受多种病原微生物引起感染中起关键性作用，如革兰阴性和阳性细菌、酵母菌和一些有包膜病毒[1]。唾液支原体是一种与人类牙周病密切相关的病原体[2]，目前hBD-2在抵抗唾液支原体感染中的作用还不是完全清楚。本研究试图通过检测hBD-2在上皮细胞中的表达以及是否对唾液支原体具有抗菌作用来探讨其防御机制。

1 材料和方法

1.1 试剂与菌株

hBD-2购自Merk。牙龈上皮细胞(HGEC)的制备按照有关参考文献的方法进行[3]，唾液支原体来自ATCC(ATCC 23064)。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒购自大连宝生物公司，其余试剂均为分析纯产品。

1.2 抗菌活性检测

唾液支原体(ATCC23064)于含有10%马血清、1%酵母浸液，1%精氨酸、1000u青霉素的PPLO肉汤培养基(pH7.0)中培养。当pH值上升一个单位，15000g离心15min，无菌PBS洗涤3次并用含有1%明胶的Hank’s液重悬浮。

1.3 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)

收集HGEC细胞，按5×104/孔接种至包被有Ⅰ型胶原的6孔板中。待其生长2d后加入上述菌液(使用时稀释10倍)混合培养培养。收集细胞在4℃1500g离心5分钟得到沉淀。沉淀物用来提取RNA，用AMV逆转录酶XL和TaKaRa Ex Taq聚合酶依照说明书操作进行cDNA合成和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)(Takara)。人hBD-2和GAPDH(用做内对照)的引物由上海生工合成，序列分别如下[4]：hBD-2：上游：5’-GGAGCCCTTTCTGAATCCGCA-3’，下游5’-CCAGCCATCAGCCATGAGGGT-3’；GAPDH：上游：5’-GTC AAG GCT GAG AAC GGG AA-3’，下游5’-GCT TCA CCA CCT TCT TGA TG-3’。产物长度分别为254bp和613bp。具体反应条件如下：94℃1min，63℃1min，72℃1min，共33个循环。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳用溴化乙锭染色并经凝胶成像系统成像。

2 结果

2.1 唾液支原体能诱导HGEC细胞表达hBD-2mRNA

图1所示，唾液支原体感染后能诱导HGEC细胞表达hBD-2 mRNA。而β-actin的无明显变化。

2.2 hBD-2的抗菌活性

hBD-2的抗菌活性如图2所示，hBD-2在1～4μM呈剂量依赖性，在4μM浓度时，唾液支原体数量比对照物抑菌率达86%。

3 讨论

由于长期滥用抗菌药物，细菌耐药性问题已经成为医学界的一大难题。目前寻求天然抗菌活性药物已成为当今研究的热点。hBD-2是一类可诱导表达的人类抗微生物多肽，正常情况下在皮肤、肾脏、鼻黏膜等组织中甚少表达，而在感染和炎症状态下才大量表达，本研究结果显示，唾液支原体感染后，能诱导HGEC细胞表达hBD-2mRNA。抑菌结果可以看出，在4μM浓度时，对唾液支原体的抑制率将近达90%。以上结果说明其在人体的防御体系中可能发挥着一定的作用：感染可明显诱导或增强hBD-2的表达水平，hBD-2不仅可以直接抵抗病原微生物的感染，而且还可以通过启动获得性免疫系统来提高机体抵抗微生物感染的免疫水平。

关于hBD-2抗微生物的机制主要是诱导微生物细胞膜上形成孔道而杀伤靶细菌。大多数原核生物胞膜带负电荷，而正常的真核细胞由于细胞骨架系统高度发达，胆固醇含量较高，负电荷较少，因而不与hBD-2发生作用。此外，hBD-2的抗微生物活性还受到某些因素的影响，如环境中的盐浓度和离子种类等。由于hBD-2杀菌具有独特性，不易耐药，因此对它的研究及应用已成为生物制药领域中的热点，将对新疫苗的发展起到重要作用。

[1]Abiko Y,Saitoh M,Nishimura M,et al.Role of beta-defensins in oral epithelial health and disease[J].Med Mol Morphol.2007 Dec,40(4):179-184.

[2]Johnson SM,Bruckner F,Collins D.Distribution of Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma salivarium in the synovial fluid of arthritis patients[J].J Clin Microbiol,2007 Mar,45(3):953-957.

[3]Mahanonda R,Sa-Ard-Iam N,Eksomtramate M,et al.Cigarette smoke extract modulates human beta-defensin-2 and interleukin-8 expression in human gingival epithelial cells[J].J Periodontal Res,2009 Aug,44(4):557-564.

[4]Han JH,Kim MS,Lee MY,et al.Modulation of human betadefensin-2 expression by 17beta-estradiol and progesterone in vaginal epithelial cells[J].Cytokine,2009 Oct 8.

[5]Dann SM,Eckmann L.Innate immune defenses in the intestinal tract[J].Curr Opin Gastroenterol,2007 Mar,23(2):115-20.