黑穗醋栗花中RNA提取方法的比较研究

赵 慧，李兴国，于泽源

（东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）

从植物中提取较高质量的总RNA是顺利进行基因表达模式，克隆基因等各种分子生物学研究的基础。常用的RNA提取方法有异硫氰酸胍法[1]、盐酸胍法[2]、苯酚法[3]、SDS 法[4]、CTAB 法[5]、LiCi尿素法[6]、热硼酸法[7]、改良Bugos法[8-9]等。植物组织中的多酚、多糖和蛋白质以及其他代谢物质均能影响RNA的提取[10]。由于不同植物不同组织，甚至同一植物不同发育期，植物所含化学成分不同，影响植物RNA提取的因素亦不同，因此应该针对植物材料的具体特点选择适宜的总RNA提取方法。黑穗醋栗是虎耳草科茶 藨 子 属小灌木，从当前的研究来看，关于黑穗醋栗分子生物学领域的研究报道较少，本研究的宗旨是筛选出适合黑穗醋栗花中总RNA的提取方法，为黑穗醋栗分子生物学领域的研究提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

在黑穗醋栗（布劳得）盛花期，采摘完整的花朵，迅速投入液氮中冷冻备用。

1.1.2 试剂

CTAB、DEPC、SDS、氯化锂、β-巯基乙醇、醋酸钠、EDTA、Tris苯酚等购自上海生物工程公司；琼脂糖为西班牙原装；DNaseⅠ、RNase抑制剂、反转录试剂盒等购于PROMEGA公司；其他的化学试剂均为国产分析纯。

1.1.3 试验耗材及仪器

所用试剂瓶和塑料耗材均预先用0.1%DEPC水处理24 h以上，50～60℃烘干，并高压灭菌20 min。研钵150℃烘干4 h后低温冷冻，所需试剂均用0.1%DEPC水配制，并湿热灭菌20 min避免RNase污染。仪器为琼脂糖水平电泳槽，琼脂糖电泳仪，高速低温冷冻离心机，电子天平，超低温冰箱，电热恒温水浴锅，漩涡振荡器，超净工作台等。

1.2 方法

1.2.1 CTAB法

参照温鹏飞葡萄果皮中RNA的提取[5]。

1.2.2 植物RNA提取

RNA提取试剂盒（天泽公司植物RNA out编号3080-10的试剂盒，略有改动）。

取0.2 g样品液氮研磨成粉后迅速放入预冷离心管中后加入1 mL A溶液匀浆，加入0.3 mL溶液B和0.2 mL氯仿。充分振荡混匀。12 000 r·min-1离心3 min后移入新的离心管中，加入0.5 mL溶液C和0.2 mL氯仿充分振荡混匀。12 000 r·min-1离心3 min后移入新的离心管中，加入1/2体积的溶液D，振荡混匀后离心20 min，弃上清75%乙醇洗涤2次，沉淀用40 μL DEPC水溶解待用。

1.2.3 硼砂-SDS法

参照许平等总RNA的提取[11]，略有改动。1.5 mL离心管中加入0.6 mL SDS提取液，0.06 mL β-巯基乙醇，0.4 mL Tris苯酚和0.3 mL氯仿，取样品0.2 g液氮研磨后迅速加入离心管中，用漩涡振 荡 器 振 荡 约 3 min，10 000 r·min-1离 心5 min，取上清，加入0.3 mL Tris苯酚和0.3 mL氯仿，用漩涡振荡器剧烈振荡2 min，10 000 r·min-1离心5 min，取上清。等体积氯仿重复抽提一次取上清，加入等体积10 mol·L-1氯化锂和1/2体积的无水乙醇，冰浴10 min，1 000 r·min-1离心10 min，沉淀RNA。沉淀加300 μL DEPC水，30 μL 3 mol·L-1醋酸钠和 900 μL无水乙醇，冰浴 10 min，12 000 r·min-1离心 10 min，弃上清，75%乙醇洗涤2次，沉淀用40 μL DEPC水溶解待用。

1.2.4 Trizol法

取0.2 g样品液氮速冻研磨后，迅速加入1 mL Trizol试剂，充分摇匀，室温放置5 min，加入0.2 mL氯仿：异戊醇（24：1）剧烈震荡15 s，室温放置2 min。4℃ 12 000 r·min-1离心 15 min，取上清，弃沉淀，上清转入新离心管中。加入0.5 mL异丙醇，混匀，室温放置10 min。4℃12 000 r·min-1离心10 min，弃上清，沉淀用75%乙醇洗涤2次，40 μL DEPC水溶解待用。

1.2.5 合成

按照PROMEGA反转录试剂盒的说明对硼砂-SDS法提取的总RNA进行反转录，方法如下：在tube-1 中 加 入 总 RNA，8.0 μL 和 oligo dT（20 μmol·L-1）2.0 μL，70 ℃水浴 5 min 后直放到 42 ℃水浴1～2 min。在200 μL tube-2中加入下列成分：5.0 μL，M-MLV（5×Buffer）；1.25 μL，10 mol·L-1d NTP mix；1.0 μL，rRNAsin（40 U）；1.0 μL，MMLVRT（200 U）；4.75 μL，DEPC 和 tube-1 体系相加为25 μL。42℃水浴1～2 min。保持42℃，两管混合42℃，60 min；70℃，15 min。最后-20℃保存。

2 结果与分析

2.1 凝胶电泳分析

2.1.1 不同提取方法的黑穗醋栗花朵RNA样品的凝胶电泳分析

取 3 μL RNA 样品与 2 μL 6×Loading buffer混合后进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，电压为120 V，电流100 mA，功率256 W的条件下电泳15 min，在紫外凝胶成像系统上观察RNA条带的清晰度和完整性并拍照。可见利用CTAB提取的总RNA可以看出18S和28S条带，但是降解严重（见图1-A）。Plant out RNA试剂盒琼脂糖凝胶电泳检测后呈现两条清晰的条带，分别为28S和18S RNA，二者亮度比约为2：1，条带无明显降解（见图1-B）。利用硼砂-SDS法提取的RNA，28S和18S两条带型清楚，而且28S rRNA无论在质量和亮度上均是18S rRNA的两倍。两条带之间无弥散现象，排除RNase污染，未发生明显降解现象（见图1-C）。Trizol法提取黑穗醋栗花的总RNA无任何条带，表明该方法不适用于黑穗醋栗花总RNA提取（见图1-D）。

2.1.2 cDNA检测

进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，电压为120 V，电流100 mA，功率256 W的条件下电泳30 min，在紫外凝胶成像系统上观察cDNA条带并拍照。反转录可得500～1 000 bp之间的弥散cDNA条带。

图1 黑穗醋栗花朵总RNA电泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of blackcurrant flower total RNA isolated with different methods

图2 反转录Fig.2 cDNA

2.2 RNA样品的质量检测分析

紫外分光光度计定量测定和纯度分析见表1。取2 μLRNA样品稀释50倍，在紫外分光光度计测定230、260和280 nm波长下OD值，计算出OD260/OD280和OD260/OD230的值以确定提取的黑穗醋栗RNA的纯度。

通过如下公式计算产率：

RNA 样品的产率（μg·g-1）=OD260×N（样品稀释倍数）×40（μg·mL-1）×V（mL）/样品重（g）。

表1 不同提取方法得到黑穗醋栗花朵中总RNA的OD值和得率Table 1 OD value and yield of the blackcurrant total flower RNA isolated with different methods

排除Trizol法未提取出黑穗醋栗花朵中的RNA，分别对其他3种方法所得的RNA的OD值进行比较，CTAB法所得的RNA的纯度较低，D260/D280为1.62，植物RNA提取试剂盒法提取的RNA纯度较高，OD260/OD280为1.9，硼砂-SDS法提取的纯度最高，OD260/OD280达到2.06，这说明用此方法提取的总RNA纯度高，经计算得出总RNA产率达 61.60 μg·g-1，说明硼砂-SDS法提取的黑穗醋栗花朵中的总RNA可用于分子克隆试验研究。

综合纯度，完整性和产量等因素，认为硼砂-SDS法最适合黑穗醋栗花朵中总RNA的提取。其余方法提取出的总RNA OD260/OD280和OD260/OD230的值都小于2.0，说明存在蛋白质、酚类、多糖的污染，总 RNA 得率不足 60 μg·g-1。

3 讨论

RNA提取的影响因素有很多，不同植物或者同一植物不同器官的组分和含量就有很大的差异。酚类化合物、多糖、蛋白质和未知次级代谢产物是影响植物组织RNA提取的几个主要干扰因素[12]。近年来有关木本植物RNA提取的方法有很多的文献报道[10,13-15]，但是在植物材料匀浆时，这些富含酚类物质会释放出来，氧化后使匀浆液变为褐色，并随氧化程度的增加而加深，这一现象被称为褐化效应（Browning effect）。被氧化的酚类化合物（如醌类）能与RNA稳定地结合，从而影响RNA的分离纯化。黑穗醋栗花朵和其他的木本植物相似，体内含有较多的次级代谢物质，严重影响RNA的提取，因此去除酚类化合物是该样品RNA提取的一关键因素。

常用的RNA提取方法CTAB法很适合于糖类含量高[5]，富含酚类化合物多的样品[16]，但试验发现CTAB法提取的时间较长，虽然可以提取出RNA，但该方法操作复杂繁琐，需2 d才能完成而且降解严重。Trizol提取过程简单方便，适用于提取很多种植物叶片的RNA，但是却不适合去除次生代谢物含量高的样品，在黑穗醋栗的花朵中没有明显的效果，不适合该种样品的RNA提取。而Plant out RNA试剂盒用时较短，但纯度较SDS法低，且价格相对昂贵。

4 结论

硼砂-SDS法，结合了各种方法的优点，用硼砂取代Tris-HCL，克服了Tris对DEPC的敏感，无法用DEPC处理的缺憾。其次利用高盐LiCl可以选择沉淀总RNA使部分多糖留在溶液中而不随RNA沉淀下来，这样极大地降低了沉淀中多糖的含量。而试验中SDS、氯仿等又是蛋白质变性剂，可以明显的使RNase丧失活性[11]。并且硼砂-SDS法试验成本较低，试剂配制简单。可为其他果树花期次级代谢物含量较高的花朵的总RNA提取提供参考。

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