致鸡产蛋下降禽病原的检测基因诊断芯片的研制及临床应用

张 伟,任素芳,田振宇,郑彤彤,张秀美,徐怀英

(1.山东省农业科学院,山东 济南 250100;2.山东澳兰生物工程研究院,山东 青岛 266101)

近年来,禽的病毒病变得更加复杂,混合感染﹑交叉感染已成为目前疾病的显著特征,本研究旨在现有探针反相杂交技术的基础上融合基因芯片的基本原理,将导致鸡产蛋下降的常见6种病原的高度保守片段(探针)用物理和化学的方法固定在硝酸纤维膜上,制成临床诊断用低密度基因芯片。现将研究情况报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要毒株与试剂 NDV(F48E9)、H9(A/Chicken/Guangdong/SS/94)、IBV(M41)、EDS-76(B4)、ILT(Blen)、MG(NB72)均购自中国兽医药品监察所;裂解液、(预)杂交液、杂交洗涤液、底物液、酶联缓冲液、显色底液由研究室配制[1]。

1.2 6种病原探针引物的设计 寡核苷酸引物根据GenBank中已发表的序列分别查找到NDV、AIV 、IBV 、EDS76、ILT 、MG 多条全长序列,使用DNAStar分析每种病毒的高度保守序列[2-3]。用Oligo 6.0软件设计合适的引物见表1。

1.3 6种病原探针质粒的克隆构建 提取6种病原的核酸扩增、纯化与pMD18-T载体连接,随后转入JM109大肠杆菌感受态细胞,筛选重组克隆质粒[3]。

1.4 基因芯片的制备 将核酸探针进行纯化并定量稀释到100 ng/μL,用微量点样器点在预处理的硝酸纤维素膜上[4]。在电热鼓风干燥箱中80℃烤膜2 h,完成基因芯片的制备。

表1 DNA阵列引物序列

1.5 检测样品的制备和标记 取预处理的组织匀浆液采取碱裂解的方法提取核酸。将6种病原混合引物(各20 pmol/μ L)加入反转录体系进行转录。转录中加生物素Bio-11-dUTP进行标记[5]。

1.6 基因芯片杂交和芯片扫描杂交结果的分析参照文献[1]的方法进行(预)杂交。杂交完毕的芯片用扫描仪进行扫描分析,根据样品的分析设置:读数0.1以下为阴性,0.2以上为阳性,两者之间为可疑[6]。

图1 芯片扫描仪下的芯片整理数据

1.7 基因芯片的灵敏度检测 为了检验本研究所建立方法的灵敏性,将NDV的感染尿囊液作10-1～10-10倍比稀释,分成3份,一份做芯片检测,一份做RT-PCR,另一份做病毒分离。

1.8 基因芯片的特异性试验 将6种混合引物同时进行RT-PCR反应,依次减少一种引物进行芯片的特异性试验。

1.9 基因芯片的动物试验和临床中试 将20只120日龄SPF鸡随机分成2组,每组10只,分别接种低致病性AIV H9。死鸡及时送检观察病变,取心 、肝、脾、肺 、肾、胸肌 、腿肌 、翅肌、气管、直肠、骨髓组织匀浆提取核酸。

2 结果

2.1 灵敏度试验结果 芯片灵敏度高于RT-PCR和病毒分离,分别为RT-PCR和病毒分离的104倍和105倍。RT-PCR检测鸡胚感染尿囊液的最高稀释度为10-7,病毒分离检测鸡胚感染尿囊液的最高稀释度为10-8,而芯片可检测到的最高稀释度为10-11,见表 2和图2。

表2 新城疫芯片灵敏度试验

图2 基因芯片的灵敏度检测

2.2 特异性试验结果 6种混合引物同时进行RT-PCR反应,依次减少的种毒核酸时进行芯片检测,各芯片上特异性杂交点呈强阳性,非目的性杂交点为阴性。

2.3 动物试验检测结果 在不同的组织匀浆液中提取的核酸芯片检测,基因芯片的灵敏度明显高于RT-PCR和病毒分离,分别为病毒分离、RT-PCR的102和103倍。见表3。

2.4 临床试验结果 自2007年2月起开始应用以来,诸城绿安有限公司和济宁天诺雅动物保健有限公司集中做试点,经对918例各种死淘病鸡的检测,检出鸡新城疫病毒感染的鸡158例,传染性支气管炎病毒的病鸡108例,鸡减蛋综合征病毒43例,低致病性禽流感病毒11例,鸡毒支原体病14例,其中混合感染109例。

3 讨论

本试验采用基因芯片的基本原理,建立了检测致鸡产蛋下降疾病低密度基因芯片技术平台。通过试验证明,此项技术可对常见鸡产蛋下降疾病做出迅速、准确、并行的鉴别。通过特异性试验证明,此技术特异性良好。和其他病原无交叉反应,且芯片上不同病原间也无交叉反应,试验结果与预期结果一致。本试验方法采用杂交显色技术,对结果也可目测判定,生产成本仅为数万元,更有利于普及和推广[7]。

表3 芯片检测AIV感染动物试验

[1]马立人,蒋中华.生物芯片[M].北京:化学工业出版社,2002:101-260.

[2]殷震,刘景华.动物病毒学[M].2版.北京:科学出版社,1997.

[3]Joseph Sambrook,David W Russell.Molecular cloning:A Laboratory Manual[M].3rd ed.Publishiing Company of Science,2002:85-98.

[4]Cheng J,Xing W.T he Fronriers of Biochip Technology[M].New York:U.S.A.Kluwer Academic Publishers,2005.

[5]张伟,吴时友,尹燕博,等.狂犬病诊断基因芯片的建立和检测应用的初步研究[J].中国预防兽医学报,2008,30(2):136-140.

[6]Xing W,Cheng J.Experiments in Biochip Technologies[M].T singhua University Press,2006:184-193.

[7]Saif Y M.Diseases of Poultry[M].11st ed.Beijing:Publishiing China Agricultural University Press,2005.