白芍水提物对cAMP-磷酸二酯酶活性影响及其抗炎效果观察

陈益山,巩忠福,姜代勋,李 佳,陈 丽,任 超,穆 祥,陈 武

(1.兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京 昌平 102206;2.北京农学院动物科学技术学院,北京 昌平 102206;3.中国兽医药品监察所,北京 海淀 100081)

白芍为毛茛科植物芍药(Paeonia lacti f lora Pall)的干燥根,具有平肝止痛、养血调经、敛阴止汗之功效[1]。药理研究表明,其有抗炎、解痉、护肝、免疫调节等作用。研究表明,临床上常见炎症性疾病多与中性粒细胞的炎性反应密切相关[2-3],而磷酸二酯酶(PDE)可以通过调节细胞内cAMP水平发挥抗炎作用[4],本试验通过检测白芍水提物对中性粒细胞PDE活性和炎症病理模型的影响,分析其抗炎的相关机理与效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD雄性大鼠60只,体重150～180 g,购于中国科学院遗传与发育研究所实验动物中心。

1.2 主要试剂 cAMP、Rolipram、角叉菜胶、弗氏完全佐剂(Sigma公司),PBS(pH值7.4),钙镁PBS(pH值7.4),中药白芍饮片(北京同仁堂药店)。

1.3 白芍水提物的制备 白芍水提物的制备方法参照韩太云等人的方法[5],将购买的白芍饮片用蒸馏水淋洗1次,加蒸馏水煎煮2次,煎液减压浓缩至1 g/mL生药。加无水乙醇使其浓度达到70%,边加边搅拌,4℃放置24 h,取上清液用氢氧化钠调pH值为7.5～8.0,放置12 h,取上清液挥发掉乙醇,将药液浓缩至1 g/mL生药。放置12 h,离心取上清液浓缩干燥,得白芍水提物。

1.4 中性粒细胞cAMP-PDE活性检测 中性粒细胞cAMP-PDE活性影响的检测方法参考张冰等的方法[6]。cAMP浓度为100 μ mol/L,白芍水提物的反应浓度为10 mg/mL,阳性对照为Rolipram,反应浓度为 100 μ mol/L,均用 PBS配制。空白组:cAMP 40μL,对照组 :cAMP 40μL 、酶样品 20μL,白芍水提物组:cAMP 40μ L、白芍水提物 10μL、酶样品 20μL,Rolipram 组:CAMP 40μ L 、Rolipram 10.0μL、酶样品 20μL,所有体系加 PBS 补足100μL 。

1.5 大鼠角叉菜胶致足肿胀模型试验 将大鼠随机分成6组,每组10只。白芍水提物设高、中、低3个浓度,分别小鼠腹腔注射白芍水提物10 g/kg、5 g/kg、2.5 g/kg体重;阳性对照组,腹腔注射Rolipram 2.75 mg/kg体重;正常对照组和模型组,腹腔注射等容积的生理盐水。给药30 min后,正常对照组每鼠右后足跖皮下注射0.1mL生理盐水,其余各组每鼠右后足跖皮下注射1%角叉菜胶0.1mL造模。致炎前按照余华保等人[7]的玻璃容器法测定大鼠右后足跖的容积,致炎后2,4 h和6 h再测量3次,以mL为单位计算其肿胀。以致炎前后足跖容积的差值计算肿胀度,并算出各用药组的抑制率,肿胀抑制率=(模型组肿胀度-给药组肿胀度)/模型组肿胀度×100%。

1.6 大鼠佐剂性关节炎模型试验 分组给药同上1.5。正常对照组每鼠左后足跖皮下注射0.05mL的生理盐水,其余各组每鼠左后足跖皮下注射完全弗氏佐剂0.05mL造模。致炎前用千分尺测量大鼠左后足跖的厚度,致炎后3 h、6 h、15 h再测量3次,以mm为单位计算其肿胀。以致炎前后足跖厚度的差值计算肿胀度,并算出各用药组的抑制率。

1.7 数据处理 数据分析采用样本间t检验。

2 结果与分析

2.1 白芍水提物对中性粒细胞cAMP-PDE活性的影响 白芍水提物在10 mg/mL的反应浓度下,能极显著的抑制cAMP-PDE4的活性(P＜0.001),其抑制率显著高于Rolipram组。结果见表1。

表1 白芍水提物及Rolipram对cAMP-PDE活性的影响

2.2 白芍水提物对大鼠角叉菜胶致足肿胀的影响与空白对照组相比较,模型组致炎后大鼠足跖容积极显著性变大(P＜0.001),说明造模成功。白芍水提物各浓度组及Rolipram组对大鼠足肿胀在致炎后2 h、4 h和6 h均有显著抑制作用(P＜0.05),并且随剂量的增加,其足肿胀度逐渐减小,抑制率逐渐提高,结果见表2和表3。

2.3 白芍水提物对大鼠佐剂性关节炎的影响 模型组大鼠左后足跖极显著肿胀(P＜0.001)。白芍水提物各浓度组及Rolipram组给药后的大鼠原发性足跖肿胀均受到显著的抑制(P＜0.05),并且随剂量的增加,其足跖肿胀度逐渐减小,抑制率逐渐提高,结果见表4和表5。

3 讨论

大部分研究报道所用白芍的成分都是通过有机溶剂乙醇萃取获得[8],考虑到传统中药均采用水煎煮的方法,水溶性成分可能更能真正代表其传统作用成分。因此,本试验通过水提醇沉法提取了白芍中的水溶性成分,检测其对cAMP-PDE活性的影响,观察其抗炎效果并分析机理。

表2 白芍水提物对大鼠足肿胀的影响 (mL)

表3 白芍水提物各组大鼠足爪肿胀度(mL)和抑制率(%)

表4 白芍水提物对佐剂性关节炎大鼠足跖肿胀度的影响 (mm)

表5 白芍水提物各组大鼠足跖肿胀度(mm)和抑制率(%)

结果表明,白芍水提物对中性粒细胞中cAMPPDE活性具有极显著的抑制作用。并且对大鼠角叉菜胶致大鼠足肿胀和佐剂性关节炎的足肿胀两种炎症模型均显示出了极显著的抗炎效果,并与剂量呈正相关。大鼠角叉菜胶致大鼠足肿胀和佐剂性关节炎的发生与炎症局部中性粒细胞活化和浸润及前列腺素E2合成增加有关[9-10],而cAMP具有抑制中性粒细胞活化及前列腺素 E2过度合成的作用。PDE是cAMP的惟一水解酶,对调节细胞PDE水平起着关键性作用。因此,白芍水提物的作用可能是通过抑制PDE活性,升高cAMP水平,进而抑制大鼠角叉菜胶致足肿胀和佐剂性关节炎的足跖肿胀部位中性粒细胞活化和浸润及前列腺素E2增加,从而发挥良好的抗炎效果。

白芍水提物中含有的具体抗炎成分及临床抗炎疗效有待进一步研究。

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