HPLC法测定罗红霉素分散片含量的测量不确定度分析

左登平，何亚琼，汪正宇(.安徽宿州市药品检验所，宿州市34000；.安徽宿州卫生学校，宿州市34000)

测量不确定度是指“表征合理地赋予被测量值的分散性，与测量结果相关联的参数”，它是指测量客观值在某一量值范围内的一个评定，不确定度越小，测量结果的质量越高，使用价值越大[1]。罗红霉素是一种抗菌谱与红霉素相似，不良反应低于红霉素的大环内酯类抗生素，其含量测定结果的准确性是评定药品质量的重要指标。本文根据2010年版《中国药典》(二部)质量标准[2]，并参考有关文献[3，4]，应用高效液相色谱法(HPLC)对罗红霉素分散片进行含量测定的测量不确定度进行分析，以期找出影响不确定度的因素来进行评估，为该药品的评价检测报告提供科学依据。

1 仪器与试药

LC-10Atvp型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；SPD-10Atvp型紫外检测器；电子天平(型号:AB 135-S，d＝0.01 mg)。

罗红霉素对照品(中国药品生物制品检定所提供，批号:130557-200502，纯度:94.1%)；罗红霉素分散片(江苏恒瑞股份有限公司，批号:09121951，规格:0.15 g)；乙腈为色谱纯，水为纯化水，其它试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 色谱条件与系统适用性

色谱柱:Phenomenex ODS C18(4.6 mm×150 mm、5µm)；流动相:水-乙腈-冰醋酸(65∶35∶1)；检测波长:210 nm；流速:1.0 mL·min－1；进样量:20µL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取罗红霉素对照品适量(对照品1为24.40 mg，对照品2为24.30 mg)，置25 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取本品10片，精密称定，研细，精密称取细粉适量(A样97.60 mg，B样93.50 mg)，置于50 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 样品测定

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20µL，注入液相色谱仪，测定，按外标法(峰面积)计算含罗红霉素96.8%。

2.5 测量数学模型

根据测定原理和过程，含量计算公式为:

其中，Y:罗红霉素分散片标示量的百分含量；A样:供试品峰面积；A对:对照品峰面积；W对:对照品重量(mg)；W样:供试品重量(mg)；W:供试品平均片重(mg)；f对:对照品稀释倍数(mL)；f样:供试品稀释倍数(mL)；标示量为0.15 g。导出方差:

3 不确定度分析

3.1 测量和分析不确定来源

3.1.1 玻璃仪器引起的相对标准不确定度:(1)校准。试验中所用玻璃仪器有:A级25 mL、50 mL量瓶，由文献[5]得容量允差分别为±0.03 mL、±0.05 mL。由于标定值比极限值出现的可能性更高，按三角分布，由允差引起的标准不确定度分别为:u(25)＝0.03＝1.22×10－2mL、u(50)＝0.05/＝2.04×10－2。(2)温度。量瓶和溶液的温度与校正时温度不同和实验室温度变化而引起的体积不确定度。由于供试品溶液和对照品溶液是在相同条件下配制，温差和溶剂的膨胀系数相同，故温度引起的偏差被抵消。玻璃仪器引起的相对标准不确定度为:urel(25)＝u(25)/25＝4.90×10－4、urel(50)＝u(50)/50＝4.08×10－4。

3.1.2 对照品称量的相对标准不确定度ure(lW对):(1)天平称量重复性不确定度。所用电子天平(d＝0.01 mg)的鉴定证书给出的重复性误差为±0.02 mg，按矩形分布:W对－01＝0.02/＝2.08×10－2。(2)天平示值不确定度。所用电子天平的鉴定证书给出的最大允差为±0.1 mg，按矩形分布:W对－02＝0.1/＝6.93×10－2mg试验平行称取对照品2份，每份对照品称量的相对标准不确定度分别为:对照品1的ure(lW对a)＝，对照品2的urel(W对b)＝。所以，对照品称量的相对标准不确定度为:10－3。

3.1.3 对照品峰面积的相对标准不确定度urel(A对):(1)对照品溶液1测量5次，峰面积分别为1707730.6、1699434.0、1716899.2、1708867.0、1710052.1，平均峰面积A对1＝1708596.6，标准偏差SD＝6241.55urel(A对1)＝SD/A对1＝6241.55/1708596.6＝3.65×10－4。(2)对照品溶液2测量5次，峰面积为:1711445.0、1711940.4、1687465.6、1697386.5、1709847.5，平均峰面积A对2＝1703617.0，标准偏差SD＝10828.9同上可得:urel(A对2)＝SD/A对2＝10828.9/1703617.0＝6.36×10－3对照品溶液色谱峰面积引起的相对标准不确定度:

3.1.4 对照品稀释引起的相对标准不确定度urel(f对):对照品配置过程中使用2个A级25 mL量瓶。由配置引起的相对标准不确定度为:

3.1.5 对照品纯度的相对标准不确定度ure(lS):对照品纯度的标准不确定度u(S)属B类不确定度。罗红霉素对照品由中国药品生物制品检定所提供，纯度为94.1%。由于目前没有给出不确定度的其他说明，故暂假定其分散区间的半宽度a＝0.25%[6]，按均匀分布换算:u(S)＝0.25%/＝0.14%，其相对标准不确定度为

3.1.6 供试品称量的相对标准不确定度ure(lW样):(1)天平称量重复性不确定度。同“2.6.2(1)”项，W样－01＝0.02/＝2.08×10－2。(2)天平示值不确定度。同“2.6.2(1)”项，W样－02＝0.1/＝6.93×10－2。试验平行称取供试品2份，每份供试品称量的相对标准不确定度分别为:供试品A样的ure(lW样a)＝；供试品B样的urel(W样b)＝所以，供试品称量的相对标准不确定度为:10－3。

3.1.7 平均片重的相对标准不确定度urel():(1)天平称量重复性不确定度。同2.6.2中(1)项，u(1)＝2.08×10－2。(2)天平示值不确定度。同2.6.2中(2)项:u(2)＝0.1=6.93×10－2，装量差异实验过程中，共使用天平20次，=282.1 mg。所以，装量差异称量的相对标准不确定度为:urel()＝

3.1.8 供试品峰面积的相对标准不确定度urel(A样):(1)供试品溶液1测量峰面积5次:1866879.6、1870842.6、1869542.6、1870547.2、1866493.5，平均峰面积A样1＝1868861.1，标准偏差SD＝2047.29，相对标准不确定度:urel(A样1)＝SD/A样1＝2047.29/1868861.1＝1.10×10－3。(2)供试品溶液2测量峰面积5次:1793703.4、1792799.8、1801896.3、1792561.2、1785297.3，平均峰面积A样2＝1793251.6，标准偏差SD＝5892.51，相对标准不确定度:urel(A样2)＝SD/A样2＝5892.51/1793251.6＝7.33×10－4；供试品溶液色谱峰面积引起的相对标准不确定度为

3.1.9 供试品稀释引起的相对标准不确定度urel(f样):供试品配置过程中使用2个A级50 mL量瓶。由配置引起的相对标准不确定度为

3.2 计算合成相对标准不确定度的uC(Y)

3.3 计算扩展不确定度u(Y)

取包含因子k＝2(近试95%的置信概率)[7]，扩展不确定度为:u(Y)＝2uC(Y)＝1.6%。

3.4 不确定度测量报告及各分量所占比例

HPLC测定罗红霉素分散片含量的测量结果可表示为:(96.8±1.6)%，各相对标准不确定度所占比例见表1。

表1 各相对标准不确定度所占比例Tab 1The precentage of the relative standard uncertainty

4 讨论

由表1可见，在引起罗红霉素分散片含量测定的不确定来源各分量中，对照品的峰面积、对照品称量和供试品峰面积引起的不确定度分量所占比重较大。这主要是由于对照品和供试品称量及仪器本身不稳定等因素引起的。因此，在以后的试验中，可以通过增加测定次数和对照品的取样量等措施来减少不确定度。另外，对照品和供试品稀释倍数引起的不确定度分量所占比重相对较小。这可能与实验室加强对玻璃仪器的保养，使其保持稳定的状态有关，同时要求在实验中要加强实验过程的控制以及加强基本操作、标准操作训练，以减少随机变化和人为因素对试验结果影响。

本分析得出的扩展不确定度为1.6%，表明结果较为准确可靠，本方法可用于测定罗红霉素分散片含量的测量不确定度分析。

[1]国家药典委员会编.国家药品标准[S].WS-127(X-103)-2005(1).

[2]国家药典委员会编.中华人民共和国药典(二部)[S].2010年版.北京:中国医药科技出版社，2010:1.

[3]中国实验室国家认可委员会编.化学分析中不确定度的评估指南[M].北京:中国计量出版社，2002:1.

[4]魏吴.化学分析中不确定度的评估指南[M].北京:中国计量出版社，2002:11.

[5]国家质量技术监督局.常用玻璃量器检定规程[S].JJG196-2006.

[6]黄诺嘉，杨文红，黄奕滨.HPLC法测定芦荟胶囊中芦荟苷含量的不确定度评定[J].中国药师，2009，12(9):1318.

[7]王玉，姚克荣.HPLC法测定非那雄胺片含量及含量均匀度的不确定度分析[J].药物分析杂志，2005，25(10):1244.