2009年我国部分地区禽白血病分子流行病学调查

高玉龙，邵华斌，罗青平，潘 伟，秦立廷，孙芬芬，刘超男，高宏雷，祁小乐，王笑梅*

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室，黑龙江哈尔滨150001；2.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，湖北武汉430065)

禽白血病(Avian Leukusis，AL)是危害养禽业的一种重要传染病，是由AL病毒(ALV)引起的以造血细胞增生为主的一类肿瘤疾病，包括淋巴细胞性白血病，成红细胞性白血病，成髓细胞白血病和髓细胞样白血病。该病自1908年首次报道并分离到ALV以来，世界上许多国家都有发生，但由于该病造成的直接经济损失相对较小，并未受到重视。直到1988年，J亚群禽白血病在世界范围内发生[1]，给养禽业造成了巨大的经济损失[2]。该病的危害主要表现在以下几个方面：一是直接发病，病鸡产生肿瘤，最终死亡；二是导致感染鸡产生免疫抑制，易造成发病鸡继发其它病原的多重感染，对疫苗免疫应答差，严重影响鸡的生产性能[3]；三是通过垂直传播危害子代鸡，所以祖代或父母代鸡场一旦发病，将会严重影响鸡雏的质量。因此，ALV对养禽业造成的危害是多方面的。

禽白血病在我国已广泛存在，近几年该病的流行日趋严重，特别是自2009年初以来，湖北、山东等地鸡白血病疑似病例频发，鸡群ALV的感染率高达60%，病死率高达50%以上。为了对此次ALV的流行情况和病毒分子特征进行研究，我们先后对多个鸡场进行调研采样，收集了大量疑似ALV的病料，本研究主要对采集到的病料进行了检测，并初步分析了发病鸡群中ALVenv基因的分子特性。

1 材料和方法

1.1 病毒株及被检样品 ALV-J原型毒株HPRS-103、ALV-A标准毒株RAV-1和ALV-B标准毒株RAV-2为本实验室保存。被检样品为自2009年1月至11月初从湖北、山东、吉林、辽宁、黑龙江、安徽、宁夏、广东8个省区39个养鸡场采集发病鸡鸡的肝、脾、肿瘤等脏器采集共178份(详见表2)。这些病料均为疑似ALV，发病日龄在50 d～200 d左右，品种有海兰褐、罗曼、白羽肉鸡、地方品种等，部分鸡有内脏肿瘤和血管瘤症状。

1.2 引物设计及合成 根据GenBank中登录的HPRS103(Z46390.1)、 RAV-1(M19113.1)和 RAV-2(M14902.1)的基因序列，设计并合成4对引物(表1)，用于检测ALV-A、B和J亚群以及扩增ALV-J亚群的囊膜基因。引物由上海英俊公司合成。

1.3 前病毒基因组DNA提取 被检样品研磨后，按照常规方法提取DNA：取病料研磨液 100 μL，加入裂解液裂解后，静止5 min～10 min；酚/氯仿/异戊醇抽提，75%乙醇洗涤，RNA酶消化后，-20℃保存备用。

表1 扩增靶基因引物序列Table 1 Target ALV subgroup and oligonucleotide primers used in PCR assay

1.4 样品的PCR检测 以提取的前病毒基因组DNA为模板，分别用ALV-A、B和J亚群特异性引物 ALVAF和 ALVAR、ALVBF和 ALVBR、ALVJF和ALVJR进行PCR扩增。PCR产物经鉴定后，回收目的片段，与pMD18-T载体连接，转化感受态DH5α，挑取白色菌落，阳性质粒送上海英骏公司测序。

1.5 ALV-J阳性样品env基因的扩增 对检测ALV-J阳性的样品用env基因特异性引物ALVJEnvF和ALVJEnvR扩增囊膜基因。PCR产物连接到pMD 18-T载体，转化DH5α，选取阳性质粒送上海英骏公司测序，序列用DNAStar、Clustal X和MEGA 3.1软件进行分析。

2 结果

2.1 样品检测结果 共检测了8个省39个鸡场的178份病料，这些病料多为疑似ALV病料。疑似ALV的鸡场雏鸡生长缓慢，蛋鸡产蛋率偏低、死亡率较高。临床症状主要有消瘦、精神沉郁、食欲不振症状，爪部、翅膀及头部出现血管瘤等病变(图1)。病鸡剖解后，多数可见肝、脾肿大，部分有肾脏和腺胃肿大，有些在肝脏或脾脏有白色肿瘤(图1)。

PCR检测各鸡场样品结果见表2，结果表明：124份病料中检出ALV-J，检出率为69.7%；25份病料中检出ALV-A，检出率为13.9%；7份病料中检出ALV-B，检出率为3.9%。检测的39个鸡场中，有35个鸡场检测出ALV-J，阳性率为89.7%；有4个鸡场检测出ALV-A，阳性率为10.3%；有1个鸡场检测出ALV-B，阳性率为2.6%。

对ALV-J阳性样品的gp85基因测序后，比较分析表明有3个毒株在669位～699位之间缺失30 bp。样品间gp85基因的同源性为85.9%～99.9%，与ALV-J原型株HPRS-103的gp85基因的同源性为88.1%～98.2%。

2.2 ALV-J阳性样品env基因序列分析 选取14个ALV-J阳性样品测定了env基因序列。结果表明分离株的env基因核苷酸序列同源性为85.5%～99.3%，氨基酸同源性为84.3%～99%；与J亚群原型毒株HPRS-103的核苷酸同源性为87%～98.1%，氨基酸序列同源性为87.3%～98.2%；与其它J亚群env基因核苷酸序列的同源性为85.2%～97%，氨基酸序列同源性为83%～97.4%。遗传进化分析表明(图2)，14个ALV-J分离株分别分属于不同的分支。分离株LJL09DH02与其它分离株的遗传距离最远，与HPRS-103的氨基酸同源性仅为87.3%。4个分离株(LLN09SY02、LLN09SY11、LSD09DP03和LSD09DP04)的env基因与HPRS-103的氨基酸同源性在93%以下，其他9个分离株的env基因与原型毒株HPRS-103的氨基酸同源性可达96.6%以上。

3 讨论

根据病毒的宿主范围及交叉中和试验等将ALV分为A～J 10个亚群，其中A～D和J为外源性病毒，E～I为内源性病毒。A、B亚群是商业鸡群中最为常见的外源性病毒亚群，而C、D亚群感染率极低，几乎很难检测到；ALV-J于1988年由Payne等首次从商品代肉用鸡中分离[1]，ALV-J是一外源性ALV与禽内源性反转录病毒囊膜(E51)的重组体[4]，可以通过水平和垂直传播在鸡群中广泛传播。我国于1999年首先在江苏和内蒙古的肉鸡群中发现有髓细胞性白血病，杜岩等在该病例中分离到ALV-J毒株，随后山东、宁夏等地也有本病发生的报道[5-6]。近几年的J亚群禽白血病的病例报道表明，发病日龄比最初报道的明显提前。在本研究检测的病料中，有50日龄的发病病例，并且表现有明显的临床症状，这表明ALV-J毒株的致病性明显增强，自然感染时引起发病的日龄逐渐提前。另外，在检测的178份病料中，ALV-J感染率高达69.7%，远远高于ALV-A和B亚群的感染。而且检测的39个鸡场中，有35个鸡场是ALV-J阳性，鸡群阳性率高达89.7%，表明我国目前ALV的感染主要以J亚群为主。另外检测中还发现，ALV-A或ALV-B阳性的鸡场同样能检测到ALV-J，感染率在3.9%～13.9%。

表2 样品来源及检测结果Table 2 Background of clinic samples and the ALV detection by PCR

以前认为ALV-J主要引起肉用型鸡发病，商品莱航鸡虽然对ALV易感，但不产生肿瘤[7]。最近国内的报道白表明蛋鸡发生骨髓细胞瘤型J亚群禽白血病病例，该病造成蛋鸡产蛋量下降，死亡率明显增加[8]。ALV-J的宿主范围逐渐扩大，不仅局限于白羽肉鸡感染发病，在蛋鸡甚至我国地方品种麻鸡也普遍发生[9-10]。以往报道ALV-J主要引起成年肉鸡骨髓细胞瘤，但近些年陆续报道有血管瘤型J亚群禽白血病病例发生[11-12]，而且日趋更为常见。在本次调查中，发生J亚群禽白血病的鸡群以蛋鸡为主，发生血管瘤的病例占多数，个别鸡场有50%以上的发病鸡有血管瘤病变。

env基因与病毒的抗原性、组织亲嗜性以及毒力密切相关，是ALV致肿瘤性的关键基因[13]。env基因的变异决定了ALV-J毒株的变异，不同ALV-J毒株间的env基因同源性差异很大，而且越是新近分离到的野毒株，其与1988年分离到的英国原型毒HPRS-103的同源性越小[14]。本研究分析了同一时间不同地区的14个分离株的env基因，发现部分分离株的env基因也表现出明显的变异。根据变异程度将14个分离株分为 3类(I，II和 III)，LJL09DH02分离株属于I类，env基因与HPRS-103的同源性仅为87.3%，而与2003年美国ALV-J毒株ADOL-7501的同源性低至83%。其它9个分离株属于III类，其env基因与HPRS-103的同源性均在96.6%以上，另外4个分离株(II类)介于I和III类之间。这说明随着病原长期进化导致毒力和致瘤性等特性发生了改变，从而使得发病率、临床肿瘤病变表现越来越多样化。有关此次ALV流行，是否是由于病毒变异而引起，还有待于进一步研究。

J亚群禽白血病不仅出现发病日龄提前，宿主范围扩大等特性，而且与其它免疫抑制病混合感染严重[15-16]。本次调查中也发现，不仅ALV感染率高，而且与其他免疫抑制病混合感染相当严重(结果另文发表)。这次禽白血病的流行，给我国养禽业造成了巨大的损失，部分鸡场面临倒闭。因而有效防控ALV显得尤为重要。目前尚无疫苗防制ALV的感染，只能通过防止垂直传播和二次感染作为控制该病的手段。建议祖代鸡场和父母代种鸡场加强防控ALV重视程度，做好净化工作，提高饲养管理水平，并加强日常兽医卫生管理和消毒措施，控制其它病原的混合感染。

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