芝芪菌质多糖的制备及其增强免疫活性的初步研究

唐 宁，张敦林，张李阳

(南京晓庄学院生命科学系，江苏南京211171)

芝芪菌质是由南京晓庄学院药用菌物研究所采用双向固体发酵技术，研制出的新型预防禽流感和促生长的饲料添加剂[1]。研究发现，芝芪菌质作为饲料添加剂，可显著促进动物生长并提高动物免疫力。以复合基质与中药的混合基质通过真菌发酵得到的发酵物作为饲料添加剂可显著提高肉鸡对H5亚型禽流感病毒的免疫力[2]，但其免疫活性成分尚未确定。前期实验中我们发现芝芪菌质粗多糖具有明显的免疫增强作用[3]，本研究对芝芪菌质粗多糖进一步分离纯化，并初步检测了4种纯化多糖的免疫活性，以明确芝芪菌质增强免疫力的活性成分。

1 材料和方法

1.1 药品与试剂 芝芪菌质由南京晓庄学院药用菌物研究所提供；RPMI 1640培养基购自上海博升生物科技有限公司；刀豆蛋白A(Con A)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自上海锐聪科技发展有限公司；Hank's液购自上海超研生物科技有限公司；YAC-1细胞购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。白细胞介素2(IL-2)购自大连保税区联合博泰生物技术有限公司。

1.2 实验动物 小鼠，清洁级，体质量为18 g～20 g，购自南京医科大学实验动物中心。

1.3 芝芪菌质纯化多糖的制备

1.3.1 粗多糖的提取 250 g芝芪菌质用沸水提取，过滤，滤液浓缩后Seage法除蛋白质，30%、60%、90%乙醇分级沉淀，无水乙醇、丙酮洗涤沉淀，真空干燥，收集60%～90%乙醇沉淀的芝芪菌质多糖粗品GAP902.604 g(前期实验发现，60%～90%乙醇沉淀多糖部分免疫活性最强)。

1.3.2 多糖的分离纯化及纯度的鉴定[4]GAP90多糖粗品水溶液过硼酸型DEAE-32纤维素柱(3 cm×60 cm)，分别用水、0.l5 mol/L硼砂溶液、0.5 mol/L NaOH溶液洗脱，平衡流速22 mL/h，洗脱流速20 mL/h，洗脱液用硫酸-蒽酮法检测，至无糖流出，根据洗脱曲线，分部收集各芝芪菌质多糖洗脱液，得到4种纯化多糖 GAP-1、GAP-2、GAP-3和 GAP-4。分别将洗脱液透析、浓缩、冻干。

采用Sephadex G-100凝胶柱色谱，供试品以0.1 mol/L NaCl溶液溶解，以0.1 mol/L NaCl溶液洗脱，流速为18 mL/h。硫酸-蒽酮法跟踪检测糖含量，绘制洗脱曲线，鉴定多糖纯度。

1.4 芝芪菌质纯化多糖的免疫活性初步测定

1.4.1 对小鼠脾细胞的增殖的影响 将4种纯化多糖分别用三蒸水配制成1 mg/mL的多糖溶液。在无菌条件下，用无菌生理盐水将多糖溶液分别稀释成10-1mg/mL～10-8mg/mL 8个浓度梯度，同时设空白对照组。参照按照文献[5]方法测定570 nm处测吸光度值(OD值)。

1.4.2 对NK细胞活性的影响 取96孔微量培养板，效靶细胞比采用50∶1，具体操作参照文献[6]方法进行，酶标仪测定各孔OD490nm值。NK细胞活性(%)=(实验组OD490nm-自然释放组OD490nm)/(最大释放组OD490nm-自然释放组OD490nm)×100%

1.4.3 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的影响[7]昆明种小鼠78只，随机分为13组，每组6只，除对照组外，其他12组分别为芝芪菌质多糖GAP-1、GAP-2、GAP-3和GAP-4的溶液低、中、高剂量组，腹腔注射，剂量浓度为25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg，对照组注射等量生理盐水，每日1次。连续注射10 d后，迫杀小鼠。沿腹中线注入3 mL冰中预冷的无菌PBS-H(含10 U/mL肝素和100 g/L小牛血清的PBS)，轻轻按摩腹部5 min，剪开腹壁，吸出渗出液，再用同样容量的预冷PBS-H冲洗腹腔，合并渗出液。用预冷的RPMI 1640培养液洗涤并悬浮细胞(106/mL)，即得巨噬细胞悬液。由鸡翼下抽取静脉血；加入5倍量的Alsever's液，用PBS将红细胞比容配成5%的浓度制成鸡红细胞悬液；用巨噬细胞悬液1 mL，加入0.04 mL鸡红细胞悬液，1500 r/min离心5 min，弃上清。涂片，吉萨染色，计数，计算吞噬率。吞噬率(%)=(吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数×200个巨噬细胞-1)×100%

1.5 统计学分析 采用SAS6.1统计分析软件对试验数据进行分析，采用Mantel-Haenszel卡方检验(Chi-Square)比较对照组与给药组差异的显著性。

2 结果与讨论

2.1 芝芪菌质纯化多糖的制备和纯度检测 将60%～90%乙醇分级沉淀得到的芝芪菌质多糖粗品GAP902.604 g溶于水，过硼酸型DEAE-32纤维素柱层析分离，分别用水、0.l5 mol/L硼砂溶液、0.5 mol/L NaOH溶液洗脱，得到4种芝芪菌质多糖洗脱液，洗脱液透析、浓缩、冻干后得到4种纯化多糖GAP-1(0.498 g)、 GAP-2(0.546 g)、 GAP-3(0.666 g)、GAP-4(0.390 g)。4种多糖均为棕褐色絮状固体，易溶于水，不易潮解，无味，不溶于有机溶剂。采用Sephadex G-100凝胶柱色谱检测，4种多糖组分洗脱曲线基本为单一对称尖峰，表明供试品纯度较高，可作为免疫活性测定供试品。

2.2 芝芪菌质纯化多糖免疫活性的测定

2.2.1 芝芪菌质纯化多糖对小鼠脾细胞增殖的影响4种芝芪菌质纯化多糖对小鼠脾细胞增殖的影响结果见表1，以OD570nm值表示细胞的增殖程度。4种GAP在10-4～10-1mg/mL浓度范围内能够显著增强ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应，在10-3～10-1mg/mL浓度范围内具有剂量依赖效应，其中GAP-3增殖效果最明显。

2.2.2 芝芪菌质纯化多糖各组分对NK细胞活性的影响 如图1所示，GAP-1、GAP-3和GAP-4在各浓度下均可明显提高NK细胞的活性(p＜0.01)，GAP-3在浓度为100 μg/mL时，NK细胞的杀伤率为27%，与IL-2阳性对照组比较，有显著增强作用(p＜0.05)。GAP-4单独应用时，浓度为10 μg/mL和 100 μg/mL时较明显地增加 NK细胞的活性，GAP-2在单独应用时则只在浓度为100 μg/mL时较明显地增加NK细胞的活性。

2.2.3 芝芪菌质纯化多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的影响 由表2可以看出，4种GAP在25 mg/kg～100 mg/kg剂量范围内能够显著增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活性，而且呈剂量依赖性。其中GAP-3增殖效果最明显，100 mg/kg剂量时，巨噬细胞吞噬活性比对照组高出48.6%。

表1 MTT检测4种芝芪菌质纯化多糖对小鼠脾细胞增殖的影响(OD570nm)Table 1 MTT assay of four purified polysaccharides on splenic lymphocyte proliferation of inoculated mice(OD570nm)

表2 4种芝芪菌质纯化多糖对巨噬细胞吞噬活性的影响Table 2 Effect of four purified polysaccharides on macrophage activity(X±SD，n=6)

非特异性免疫是机体的第一道防线，作用快速而且范围广，而NK细胞和巨噬细胞因具有强大的吞噬杀伤功能，在机体的抗病毒、抗肿瘤及免疫调节中都起重要的作用，是非特异性免疫的重要组成部分[8]。本研究将粗多糖GAP90过DEAE-32纤维素离子交换柱纯化后得到4种纯化多糖。初步实验表明，4种纯化多糖均有较好的增强免疫活性作用，其中GAP-3的免疫活性最为显著，可以认定为灵芝发酵菌质的活性成分之一，为灵芝发酵菌质作为新型饲料添加剂提供了理论依据。

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