HPLC 法测定夏天无薄膜衣片中原阿片碱的含量

苏玉严，周海妹，展学孔，陈文平（.海南省农垦总局医院药剂科，海口市5703；.海南全星医药研究院，海口市 5706）

夏天无薄膜衣片为夏天无经加工制成的片剂，其功效为活血通络、行气止痛。临床上用于瘀血阻络、气行不畅所致的中风，症见半身不遂、偏身麻木，或跌扑损伤、气血瘀阻所致的肢体疼痛、肿胀麻木；风湿性关节炎、坐骨神经痛见上述证候者[1]。由于夏天无片在1994～2008年处于中药保护品种保护范围之内，所以到目前为止，尚无采用高效液相色谱（HPLC）法对夏天无薄膜衣片含量进行测定的文献报道。为此，本试验通过建立HPLC法对该药的指标性成分进行含量测定，从而为夏天无薄膜衣片的质量标准研究提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

HPLC色谱仪，配备SPD-10Avp紫外检测器、LC-10Atvp泵（日本岛津公司）；色谱柱（天津天和公司）；2010色谱工作站（浙江大学智能信息工程研究所）；紫外-可见分光光度计（日本岛津公司，型号：UV-2450）；BS 124S万分之一电子分析天平（德国赛多利斯北京有限公司）；超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司，型号：SK-2500，功率：53 kHz）；数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司，型号：HH-4）等。

1.2 试药

原阿片碱标准品（中国药品生物制品检定所，批号：110853-200402）；夏天无薄膜衣片供试品（海南全星药物研究院制剂室，批号：20090301、20090302、20090303，规格：每片重0.3 g）。乙腈、三乙胺、甲醇均为色谱纯，水为注射用水，盐酸、冰醋酸均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18（250 mm×460 mm，5 µm）；柱温：30℃；进样量：20µL；流动相：乙腈-三乙胺醋酸溶液（取三乙胺8 mL，冰醋酸30 mL，加水稀释至1 000 mL，18∶82）；流速：1.0 mL·min－1；检测波长：289 nm。理论塔板数按原阿片碱计算≥3 000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 标准品溶液的制备：精密称取原阿片碱标准品约10 mg，置于50 mL容量瓶中，用1%盐酸5 mL溶解，加入50%甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置于25 mL量瓶中，加入50%甲醇至刻度，摇匀，即得浓度为40µg·mL－1的标准品贮备液。

2.2.2 供试品溶液的制备：取本品10片，除去薄膜包衣，精密称定，研细，称取样品0.6 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50%的甲醇50 mL，称重，加热回流1 h，放冷，再称重，用50%的甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 专属性试验

精密吸取50%甲醇溶液（溶剂空白）、标准品溶液及供试品溶液各20µL，按“2.1”项下色谱条件分别注入HPLC仪。结果，原阿片碱的色谱峰保留时间适宜，且供试品溶液中主峰与其余各峰分离效果较好。色谱见图1。

2.4 线性关系考察

图1 高效液相色谱图A.溶剂空白；B.标准品；C.供试品Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank solvent；B.reference substance；C.test sample

精密吸取“2.2.1”项下标准品贮备液1、3、5、7、9 mL，分别置于50 mL容量瓶中，加入50%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度分别为8.48、25.44、42.40、59.36、76.32 µg·mL－1的系列溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样测定。以标准品质量浓度（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，制备标准曲线，得回归方程为Y＝7 505 4X－2 052 0（r＝0.999 9）。结果表明，夏天无薄膜衣片中原阿片碱的质量浓度在8.48～76.32µg·mL－1的范围内具有良好的线性关系。线性关系试验结果详见图2。

图2 夏天无薄膜衣片中原阿片碱的含量测定线性回归图Fig 2 Linear regression of content determination of protopine in C.decumbens film-coated tablets

2.5 精密度试验

取“2.2.1”项下方法制备标准品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样，重复测量6次。结果，RSD＝0.63%（n＝6），表明仪器精密度良好，详见表1。

表1 精密度试验结果（n＝6）Tab 1 Results of precision test（n＝6）

2.6 稳定性试验

按“2.2.2”项下方法配制供试品溶液1份适量，室温放置，按“2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、6、8 h进样测量。结果RSD＝0.73%，表明供试品溶液在1个工作日内稳定，详见表2。

2.7 重复性试验

取同一批样品（批号：20090301）6份，精密称定，分别为0.601 2 g、0.601 8 g、0.601 3 g、0.600 9 g、0.602 1 g、0.601 0 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，各取20µL进行测定。结果RSD＝1.25%（n＝6），表明该方法重复性良好，详见表3。

表2 稳定性试验结果（n＝5）Tab 2 Results of stability test（n＝5）

表3 重复性试验结果（n＝6）Tab 3 Results of repeatable test（n＝6）

2.8 加样回收率试验

精密称取标准品13.3 mg，置于25 mL容量瓶中，制备浓度为0.532 mg·mL－1的标准品贮备液。采用加样回收法，精密称取已测定含量（3.504 mg·g－1）的同一批号样品6份，每份0.3 g（0.302 5 g、0.298 8 g、0.300 4 g、0.302 6 g、0.299 6 g、0.301 2 g），分别加入浓度为0.532 mg·mL－1的标准品贮备液2 mL和50%的甲醇50 mL，依“2.2.2”项下方法进行溶液制备，分别吸取标准品溶液及供试品溶液各20µL进行测定，计算回收率。结果，原阿片碱的平均回收率为99.39%，RSD＝0.92%（n＝6），详见表4。

表4 加样回收试验结果（n＝6）Tab 4 Results of recovery test（n＝6）

2.9 样品含量测定

取本品3个批号（20090301、20090302、20090303；规格：每片0.3 g），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，各取20µL进行含量测定，结果见表5。

表5 样品含量测定结果（n＝3）Tab 5 Results of content determination（n＝3）

3 讨论

3.1 含量测定方法的选择

由于夏天无薄膜衣片的样品处理方法比较简单，仅是采用加热回流的方法进行提取，所以本文在选择该样品内原阿片碱含量测定方法时，优先考虑采用简单易行的外标标准曲线法，并对该方法进行系统适用性试验及含量测定方法学考察。结果，采用本法测定夏天无薄膜衣片中原阿片碱含量时，其它成分干扰较少、分离度佳、回收率高、数据准确可靠，符合国家对药品含量测定的要求。此外，在含量测定过程中，笔者采用定量环进样，这样不仅克服了外标法对进样量要求精确之难题，同时也避免了使用内标法寻找内标物的困难和操作步骤烦琐所带来的误差。

3.2 检测波长的选择

由于不同的文献报道对原阿片碱测定所采用的波长不一样，为确定试验中最终的检测波长，本文通过利用原阿片碱标准品溶液采用紫外分光光度法（《中国药典》（2005年版）附录ⅤA）测定，在波长200～400 nm范围内扫描，扫描图谱显示，原阿片碱在240、289 nm波长处有较强吸收。故根据实验结果并结合有关文献[2，3]报道，最终选择289 nm为本品的检测波长。

3.3 样品处理时间的选择

在供试品的处理当中，本文采用水浴回流的提取方法，并对回流提取的时间进行了考察。取同批等量样品3份，分别加热回流法提取45、60、75 min，得样品溶液。各取样品溶液20µL注入HPLC仪进行测定。含量测定结果表明，除了回流法提取45 min的样品含量较低之外，60 min与75 min时样品的含量无明显差异。综合考虑，最终选择样品的回流法提取时间为60 min。

综上所述，本研究建立了HPLC法测定夏天无薄膜衣片中原阿片碱含量的方法，该法简单、准确、重复性好，可用于夏天无薄膜衣片的质量控制。

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：196.

[2]潘成学，刘 伟，申小静.HPLC测定夏天无胶囊中原阿片碱的含量[J].郑州大学学报（医学版），2005，40（4）：722.

[3]李向阳，屠万倩.HPLC测定夏天无胶囊中原阿片碱的含量[J].中药新药与临床药理，2005，16（4）：272.