异甘草酸镁对慢性髓细胞性白血病K562细胞系增殖的抑制作用

迟小华，杨 波，张 峰，卢学春，刘丽宏，代汉仁（.解放军第二炮兵总医院药剂科，北京 00800；.解放军总医院南楼血液科，北京 0085；.中国科学院北京基因组研究所，北京 0009）

异甘草酸镁（magnesium isoglycyrrhizinate）是天然甘草酸的立体异构体镁盐，具有抗炎、保护肝细胞膜、抗氧化等多种功效。肝脏是血液肿瘤放化疗时最容易受到影响的器官，肝脏毒性也常常是限制放化疗剂量和治疗方案得以顺利实施的重要因素。因此，对于血液肿瘤患者化放疗期间加强保肝治疗非常必要。然而，在白血病化疗期间应用异甘草酸镁保肝治疗的同时是否对白血病细胞也具有保护作用目前尚不清楚。有研究表明，甘草酸及其衍生物对多种类型的实体肿瘤细胞具有抑制增殖和促进凋亡的作用，还可能具有逆转肿瘤化疗耐药的作用[1-3]。目前，有关异甘草酸镁对白血病细胞生物学特性的影响尚未见报道。本研究通过将不同浓度的异甘草酸镁作用于人慢性髓细胞白血病K562细胞系，观察其对白血病细胞增殖的抑制作用，为临床治疗白血病合并肝损伤提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

自动酶标仪（CHROMATE4300酶标仪，陕西展鹏科技有限公司）；二氧化碳培养箱（RCO-3000TVBB型，美国RECO）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；细胞培养瓶（加拿大BIOFIL公司）；96孔板（上海Sunub科技发展公司）；倒置显微镜（日本Olympus公司）；微量移液器（法国Pipetman公司）；电子天平（德国赛多利斯）。

异甘草酸镁（正大天晴制药有限公司，纯度98.5%，批号091231）：粉状白色结晶。RPMI 1640培养基（Gibco公司）；10%胎牛血清（杭州四季青公司）；CCK-8检测试剂盒（上海日本同仁化学研究所）。

1.2 细胞

人慢性髓细胞白血病K562细胞株由解放军总医院基础所免疫室韩为东博士惠赠。

1.3 K562细胞培养

将K562细胞置于含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1链霉素的RPMI 1640培养液中，在37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，2～4 d换液传代1次。

1.4 CCK-8法测定

取对数生长期细胞，调整细胞数为1×105～1×106·mL-1，接种于96孔培养板，每孔100 μL，12 h后加入异甘草酸镁，实验组异甘草酸镁采用无血清1640培养液稀释，贮存浓度为20 g·L-1，终稀释浓度分别为10，1，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6g·L-1；对照组加与最高浓度组等量的RPMI 1640培养液，每组设3个重复孔，分别孵育24，48，72 h。显微镜观察细胞生长状态，并摄像。实验结束，每孔加入5 mg·mL-1的CCK-8 10 μL，继续孵育2 h，置酶标仪上用450 nm和630 nm双波长测吸光度值（OD值）。检测的 OD值大小与活细胞数目呈正相关，以OD值为纵轴，作用时间为横轴，绘制细胞增殖曲线。取24 h的OD值比较各组的细胞增殖抑制率，实验重复3次。计算公式如下：

细胞增殖抑制率（%） = （1－实验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 镜下观察异甘草酸镁对K562细胞的抑制作用

药物处理第1～3天后，镜下观察10 g·L-1给药组细胞生长明显受抑，细胞数量减少；其余各药物浓度组细胞生长状态与对照组无明显差异（图1）。

图1 不同浓度异甘草酸镁作用下培养48 h K562细胞生长状态①对照组；②10 g·L-1组；③1 g·L-1组；④1×10-1 g·L-1组；⑤1×10-2 g·L-1组；⑥1×10-3 g·L-1组；⑦1×10-4 g·L-1组；⑧1×10-5 g·L-1组；⑨1×10-6 g·L-1组Fig 1 Microscopic observation of K562 cell growth 48 hours after treatment with different concentrations magnesium isoglycyrrhizinate①the control group; ②10 g·L-1 group; ③1 g·L-1 group; ④1×10-1 g·L-1 group; ⑤1×10-2 g·L-1 group; ⑥1×10-3 g·L-1 group; ⑦1×10-4 g·L-1 group; ⑧1×10-5 g·L-1 group; ⑨1×10-6 g·L-1 group

2.2 异甘草酸镁抑制K562细胞增殖的生长曲线及抑制率

不同浓度的异甘草酸镁作用于K562细胞后，对细胞的生长有明显的抑制作用，并且具有时间和浓度依赖性。接种后的细胞在48 h处于对数生长期，10 g·L-1药物浓度作用24，48和72 h后细胞生长抑制率分别为44.9%，65.9%，86.4%。异甘草酸镁作用48 h后IC50约为1.6 g·L-1（见图2、表1）。

图2 不同浓度异甘草酸镁作用K562细胞生长曲线Fig 2 Growth curves of K562 cells after treatment with magnesium isoglycyrrhizinate at different concentrations

3 讨论

异甘草酸镁是从甘草中提取的甘草酸碱催化异构化后成盐精制而得。研究发现，甘草酸通过作用于激素受体，影响离子通道等机制，不但具有类肾上腺皮质激素样作用，还具有抗炎、减轻免疫病理反应的作用，临床上已用于治疗药物性和病毒性肝炎[4-8]。对于血液肿瘤患者而言，化放疗期间同时加强保肝治疗已成为降低化放疗相关肝毒性的重要策略。异甘草酸镁在保护肝细胞的同时是否对白血病细胞的增殖也具有促进作用尚不明确。

表1 异甘草酸镁作用K562细胞48 h的生长抑制率.n = 3Tab 1 Inhibitory rate of K562 cells 48 hours after treatment with magnesium isoglycyrrhizinate.n = 3

本研究结果表明，异甘草酸镁对人慢性髓细胞白血病K562细胞系的增殖具有抑制作用；在浓度为10-2g·L-1以上时抑制作用更显著（抑制率＞ 30%），并呈剂量、时间依赖性；48 h的半数抑制浓度为1.6 g·L-1，这与文献报道的甘草酸及其类似物（甘草黄酮、甘草次酸）在较高浓度时才具有显著抑瘤作用的结果类似[9-10]。以异甘草酸镁临床常用剂量计算，体内药效学浓度与体外抑制白血病细胞增殖的浓度相近（1×10-3～1×10-2g·L-1），而此剂量范围对于正常造血功能恢复无影响。此外，我们利用生物信息学方法分析了异甘草酸镁对人类基因表达谱的影响，发现上调基因7条，下调基因22条（数据尚未发表），并初步预测出异甘草酸镁可能具有去乙酰化转移酶抑制剂曲古抑菌素样的作用，这有可能是它抑制白血病细胞增殖的分子机制。本研究为异甘草酸镁预防和治疗白血病化疗相关肝损伤提供了实验依据。异甘草酸镁抗白血病的确切机制以及是否与化疗药物具有协同抗白血病作用仍有待于深入研究。

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