厚朴AFLP分子标记体系的建立

蒋燕锋，斯金平，黄华宏，程龙军

（浙江林学院 林业与生物技术学院，浙江 临安311300）

中药材厚朴为木兰科Magnoliaceae植物厚朴Magnolia officinalis或凹叶厚朴M.officinalis var.biloba的干燥干皮、枝皮和根皮［1］。前者主要分布于四川、湖北等省，称为“川朴”，其叶型为小凸尖叶；后者主产于湖南、浙江、广西、福建等省，称为“温朴”，其叶型为凹叶。两者之间还有许多在叶形上呈中间状态的过渡类型。厚朴是中国特有的常用中药材，长期以来主要利用野生资源。一方面因资源过度消耗，日益枯竭，另一方面因利用野生资源而导致品质参差不齐，严重制约了厚朴药材现代化国际化进程。厚朴因其特殊的分类地位和资源的日益枯竭而先后被列为国家珍稀濒危植物和二级保护中药材。厚朴中药材的质量控制和品质评价对保护和发展厚朴资源，满足中药现代化、产业化和国际化的要求尤为重要。扩增片段长度多态性（AFLP）是限制性片断长度多态性（RFLP）技术和聚合酶链式反应（PCR）技术的结合。AFLP标记具有不需要预先知道基因组背景、多态位点丰富、灵敏度高和重复性好等优点，克服了RFLP检测位点有限和随机扩增多态性DNA（RAPD）不稳定等缺点［2］。AFLP问世后便在树木的数量性状定位、种质资源鉴定、遗传连锁图谱构建、群体遗传结构及多样性研究、演化和亲缘关系研究等方面得到了广泛的应用［3－8］，而对于厚朴来说，目前仅有郭宝林等［9］利用 RAPD技术探讨了厚朴种内关系和道地性问题。笔者以不同类型厚朴为试材，对实验过程中影响AFLP分析的酶切、连接、预扩增及选择性扩增的各个环节依次进行了优化，最终建立了适合厚朴的较为理想的AFLP分析体系。

1 材料与方法

1.1 材料

根据已有厚朴研究，于9月下旬至10月上旬（厚朴种子成熟期）在湖北鹤峰、浙江景宁、广西资源等3个分别代表小尖叶型、中间型及凹叶型的种源地种子，去掉外果皮后湿沙混藏。初春播种育苗于浙江林学院林木遗传育种科研苗圃。

采集正常生长的嫩叶，用冰壶带回实验室，液氮速冻后置－70℃冰柜保存。

1.2 方法

1.2.1 模板DNA的制备与检测 实验采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）-硅珠吸附法［10］提取不同样品的厚朴叶片DNA，用NanoDrop微量分光光度计（ND-1000）测定DNA的纯度和浓度。同时每个样品取5 μL，加1 μL上样缓冲液混合后，于10.0 g·L－1琼脂糖凝胶进行电泳检测，在凝胶成像系统（Gel DocTM，Bio-Rad）下观察并照相。

1.2.2 DNA的酶切与连接 酶切反应采用EcoR I和Mse I双酶切组合，参考白桦Betula platyphylla基因组双酶切体系［11］略作修改。厚朴的酶切体系为EcoR I（20×16.67 mkat·L－1，NEB）0.15 μL，Mse I（10×16.67 mkat·L－1，NEB）0.30 μL，10×NEB buffer 5.00 μL，100×牛血清蛋白（BSA）0.30 μL，加双蒸水至 25.00 μL。模板DNA用量为100～700 ng，在 37℃ 水浴酶切 1～6 h后放入 75℃ 水浴15 min，使酶失活后，立即置于冰上冷却。取 5.00 μL反应液与 1.00 μL上样缓冲液混合，于10.0 g·L－1琼脂糖胶凝胶电泳检测。连接体系 25.00 μL，含酶切产物 20.00 μL，T4 Ligase（400×16.67 mkat·L－1，NEB）0.10 μL，EcoR I 接头（E 接头，10.0 μmol·L－1）0.50 μL，Mse I接头（M 接头，10.0 μmol·L－1）1.00 μL，10×buffer 2.00 μL，双蒸水 1.40 μL。16℃ 连接过夜。接头序列如下：

1.2.3 预扩增反应 预扩增反应体系：连接产物2.00 μL，Taq DNA聚合酶（5×16.67 mkat·L－1，NEB）0.20 μL，E ＋ A 引物（50 mg·L－1）1.00 μL，M ＋ C 引物（50 mg·L－1）1.00 μL，三磷酸脱氧核苷酸 dNTPs（2.5 mmol·L－1，TaKaRa）1.60 μL，10×PCR buffer 2.00 μL，加双蒸水至 20.00 μL。预扩增在 ABI9700 PCR仪上进行。反应程序为：94℃预变性2 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，30个循环；最后 72℃ 延伸 5 min，4℃ 保持。取 5.00 μL预扩增产物与 1.00 μL上样缓冲液混合后于 15.0 g·L－1琼脂糖凝胶上电泳检测预扩增效果。

1.2.4 选择性扩增反应及其优化 选择性扩增的好坏直接关系银染效果的好坏，因此，选择扩增的优化至关重要。预扩增产物稀释一定倍数后进行选择性扩增，选择性碱基数为3。反应体系为：稀释后的预扩增产物 2.00 μL，Taq DNA 聚合酶（5×16.67 mkat·L－1，NEB）0.20 μL，E ＋ ANN 引物（20 mg·L－1）0.30 μL，M+CNN 引物（20 mg·L－1）1.80 μL，dNTPs（2.5 mmol·L－1，TaKaRa）1.60 μL，Mg2+（25.0 mmol·L－1）1.00 μL，10×PCR buffer 2.00 μL，加双蒸水到20.00 μL。预扩增在 ABI9700 PCR仪上进行。反应程序为：94℃预变性 2 min；94℃30 s，65℃ 30 s（以后降低 0.7℃·循环-1），72℃1 min，13个循环；然后在退火温度 56℃，其余条件不变的情况下，再进行23循环；72℃延伸5 min，4℃保持。在此基础上，我们从4个因素的多个水平进行选择性扩增的优化（表1），4个因素逐一优化，且一个因素优化后的结果在后续因素的优化过程中固定下来。

1.2.5 PAGE电泳及银染检测 反应结束后，选择性扩增产物与上样缓冲液（体积分数为98%甲酰胺；10.0 mmol·L－1乙二胺四乙酸（EDTA），pH 8.0； 体积分数为0.25% 溴酚蓝； 体积分数为0.25% 二甲苯青）等体积混合，95℃6 min后迅速将PCR管置于冰上以保持变性状态，然后置于－20℃冰箱用于后续的电泳检测。本实验中采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染的方法进行检测［12］。银染后的板晾干后在胶片观察灯下观察，选择那些具有清晰条带的引物作为AFLP反应的最佳引物。

表1 选择性扩增各因素处理方案Table 1 Different treatments of selective amplification factors

2 结果与分析

2.1 基因组DNA提取与检测

CTAB-硅珠吸附法提取的厚朴叶片DNA经过琼脂糖凝胶电泳检测，条带十分清晰明亮且无拖尾、背景干扰等现象（图1），表明蛋白质等杂质去除较干净，纯度较高。经测定，吸光度D260/D280比值在1.8左右，但质量浓度相对较低，在90.0 mg·L－1左右。

图1 CTAB硅珠法提取的DNA的琼脂糖电泳图Figure 1 Agarose gel electrophoresis of DNA extracted by CTAB-SiO2method

2.2 AFLP反应体系的优化

本实验分别用100～600 ng不同样品的DNA进行酶切、连接、预扩增和选择性扩增，结果在15.0 g·L－1的琼脂糖凝胶上电泳检测。以湖北五峰种源的厚朴为例（下同），扩增条带绝大部分为100～750 bp，且400 bp左右较为明亮（图2）。最后经60.0 g·L－1变性聚丙酰胺变性胶电泳，发现DNA浓度的不同没有导致DNA条带多寡的变化，而且条带的清晰度也差别不大，因此考虑DNA使用量居中，为400 ng。

图2 不同DNA用量对选择性扩增结果的影响Figure 2 Effect of different DNA treatments on selective amplification result

预扩产物的用量对选择性扩增结果有重要影响。实验中湖北五峰种源的厚朴DNA经酶切、连接和预扩后，预扩产物分别按1∶5，1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50和1∶60进行稀释，选择性扩增后在15.0 g·L－1琼脂糖凝胶上电泳检测。发现稀释倍数为20，30和40倍时，条带较清楚且较明亮，在200～300 bp之间明亮度最高，片段扩增量较多（图3）。而30稀释倍数是其中条带清晰度和明亮度是最好的，故实验选用30稀释倍数。

dNTPs，Mg2+和Taq DNA聚合酶是影响扩增效果的关键因素。不同物种的AFLP分析中，dNTPs，Mg2+，Taq DNA聚合酶的最适浓度会有所不同。

体系中的dNTPs是PCR反应的原料物质，是反应必不可少的组分之一。厚朴研究发现，体系中不同dNTP的浓度对扩增结果没有显著影响，但浓度增加可稍微提高扩增产物的得率（图4）。因此，综合考虑试验成本和扩增效率，选择厚朴AFLP选择性扩增中 dNTP浓度为0.225 mmol·L－1。

图3 不同稀释倍数预扩增产物的选择性扩增结果Figure 3 Different selective amplification results with different dilution multiple of pre-amplification products

图4 不同dNTPs浓度对选择性扩增的影响Figure 4 Effect of dNTPs concentration on selective amplification result

Mg2+可以影响酶的活性、扩增的真实性以及产物的特异性，故Mg2+浓度也是反应中不可或缺的重要因素之一。研究发现，随着Mg2+的浓度的增加，扩增也越来越清晰。而当Mg2+的浓度达到2.25 mmol·L-1时，出现了非特异性扩增，Mg2+会与dNTP结合而影响扩增效率（图5）。因此，厚朴AFLP选择性扩增体系中Mg2+的浓度为2.00 mmol·L-1。

Taq DNA聚合酶在扩增体系中起关键作用。研究发现，聚合酶为8.34～33.34 nkat时扩增产物相对较集中，且随着酶的增加，集中的 PCR产物带较清晰；41.68 nkat时可能酶的使用量过大而出现非特异性扩增（图6）。综合考虑，确定 20.00 μL反应体系中Taq DNA聚合酶使用量为16.67 nkat。

图5 不同Mg2+浓度对选择性扩增的影响Figure 5 Effect of Mg2+concentration on selective amplification result

图6 不同Taq DNA聚合酶用量的选择性扩增结果Figure 6 Different treatments of Taq DNA enzyme on selective amplification result

2.3 厚朴AFLP优化反应体系的验证

为了验证上述实验获得的厚朴AFLP优化体系的可靠性，我们对不同的厚朴样品使用E-ACA+M-CAT引物对进行选择性扩增，扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶泳检测（图7）。结果表明，不同样品条带清晰，说明优化的AFLP体系能产生较为理想的结果，这为AFLP技术体系在厚朴种质资源鉴定、遗传连锁图谱构建、群体遗传结构及多样性研究、演化和亲缘关系研究等方面的应用奠定了基础。

图7 不同样品E-ACA+M-CAT引物选择性扩增电泳图Figure 7 An electrophoretogram of different samples’selective amplification result with the primer E-ACA and M-CAT

因此，采用CTAB硅珠法提取的DNA质量较好，适用于AFLP分析。酶切的基因组DNA以400 ng为宜，37℃条件下酶切时间为6 h较理想；预扩增产物的稀释倍数以20倍为宜；20.00 μL选扩反应体系中 Mg2+浓度为2.00 mmol·L-1，dNTPs浓度为0.225 mmol·L-1，Taq DNA 聚合酶用量为16.67 nkat，扩增带清晰且稳定，扩增效果较理想，可以获得清晰的AFLP指纹图谱。

3 讨论

AFLP技术程序多且复杂，从基因组DNA的提取到电泳银染每个环节都必须严格要求，才能获得最佳的结果。模板DNA的质量和完全酶切是AFLP试验成败的关键。实验证明，用CTAB-硅珠吸附法提取的厚朴DNA质量符合AFLP技术要求。酶切时模板以400 ng为宜，酶切时间为6 h。预扩增是一承上启下的步骤，既可以检测酶切和连接的效果，又可以对选择性扩增模板起到纯化的作用。预扩产物的稀释倍数对于选择性扩增的成败非常重要，几个稀释梯度的琼脂糖电泳谱带差别不大，在垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳后稀释30倍的电泳谱带清晰，便于读取，其他稀释倍数下的扩增条带数目少、不清晰且扩增结果不稳定。Taq酶的价格比较高，摸索适当的酶用量，对试验效果及节约成本都大有益处。AFLP步骤多而且联系密切，因此，建议在厚朴AFLP分析时，每完成一步，最好取少量样品在琼脂糖凝胶上进行电泳检测，得到预期效果后再进行下一步试验。这样既节省时间，又不浪费试剂。

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