夜香牛的质量标准研究

陈黄保，胡等芳

(广东省湛江市药品检验所，广东 湛江 524037)

夜香牛为民间用药，始载于《岭南采药录》，别名伤寒草、消山虎、寄色草、返魂香、假咸虾、枝香草[1－2]，为菊科植物夜香牛 Vernonia cinerea(L.)Less的干燥全草，具有清热、除湿、解毒功效，治外感发热、急性黄疸型肝炎、湿热腹泻、疔疮肿毒。为了有效控制其质量，笔者采用显微、薄层色谱(TLC)法进行定性鉴别，用高效液相色谱(HPLC)法测定其中木犀草苷的含量，报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1100型高效液相色谱仪，含DAD检测器，Agilent 1100化学工作站;梅特勒－托利多AG135型电子天平;HENGAO HS3120型超声清洗仪(功率120 W，频率40 kHz)。D101大孔吸附树脂柱(批号为050901，天津市海光化工有限公司)。夜香牛于2006年5月在湛江自采，另由广东恒诚制药有限公司提供两批，均经广东省湛江市药品检验所王其新主任中药师及笔者鉴定为菊科植物夜香牛 Vernonia cinerea(L.)Less的干燥全草;木犀草苷对照品(批号为111520－200201，含量测定用，中国药品生物制品检定所);乙腈为色谱纯;甲醇(色谱纯，批号为051029101，天津市四友生物医学技术有限公司)，水为超纯水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 生药学鉴定

来源:本品为菊科植物夜香牛 Vernonia cinerea(L.)Less的干燥全草。原植物为1年生草本，高20～80 cm。茎直立，上部有分枝，稍被灰白色短茸毛，有纵向条纹，叶互生，具柄;叶片披针形至卵形或倒孵形，长 3.5 ～6.5 cm，宽 1.5 ～3.5 cm，先端钝或尖，基部楔形，边缘有浅齿或波状齿，背脉明显，侧脉3～4对，两面均被疏毛。花全年开放，头状花序长约 0.7 cm，宽 0.3 cm，具柄排成疏散的伞房状圆锥花序，总苞较花短，总苞片尖锐，小花约20朵，两性，全为管状花，淡紫红色。瘦果圆柱形，灰褐色，长约0.2 cm，项端被白色冠毛[3](见图1)。

图1 夜香牛原植物图

性状:本品茎呈圆柱形，上部有分枝，长20～80 cm，直径 0.2～0.4 cm;表面绿褐色，有纵皱纹，稍被白色短茸毛。叶互生，多皱缩或脱落，展开后呈披针形、孵形或倒孵形，边缘有浅齿或呈微波状。头状花序顶生，总苞绿褐色或黄棕色。瘦果圆柱形，灰褐色，长约0.2 cm，顶端被白色冠毛。根淡黄色，细小，多分支。质脆，易折断，断面髓部白色。气微，味淡(见图2)。

显微特征:本品茎横切面观呈圆形，边缘有突出的棱角。表皮细胞1列，呈类方形，外被角质层，并可见非腺毛，棱角处有厚角组织。皮层细胞类圆形，有的作径向排列，内含黄绿色色素。中柱鞘纤维束呈帽状，约16～25束断续排列成环。韧皮部窄。形成层成环，次生木质部导管呈圆形或椭圆形，直径8～56μm，单个散在;射线细胞2～9列;近髓部处有初生木质部。髓部宽广，薄壁细胞较大，呈圆多角形(见图3)。

图2 夜香牛药材图

2.2 薄层色谱鉴别

取本品粉末2 g，加水50 mL，加热回流1 h，滤过，滤液加盐酸至酸性，滤过，用乙酸乙酯振摇提取3次(每次15 mL)，合并乙酸乙酯溶液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取夜香牛对照药材2 g，同法制成对照药材溶液。照TLC法[2005年版《中国药典(一部)》附录Ⅵ B]试验，吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一以羧甲基纤维钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯－乙酸乙酯－甲酸－水(6∶3∶1∶3)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铁试液与1%铁氰化钾试液(1∶1)混合溶液。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点(见图4)。

2.3 木犀草苷含量测定

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流动相:甲醇－0.2%磷酸溶液(44∶56);检测波长:350 nm;柱温:室温;流速:1.0 mol/L;进样量:20 μL。理论板数按木犀草苷峰计算应不低于3500。色谱图见图5。

2.3.2 溶液制备

精密称取药材粉末2 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声处理(功率120 W，频率40 kHz)30 min，取出，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过;精密量取续滤液30 mL，蒸干，残渣加甲醇约5 mL使溶解，加到预先处理好的D101大孔吸附树脂柱(内径1.5 cm，柱高15 cm)上，用水50 mL洗涤，再用甲醇100 mL洗脱，弃去前15 mL，收集续洗液，蒸至近干，残渣加甲醇30 mL使溶解，转移至150 mL圆底烧瓶中，加入盐酸9 mL，置水浴中加热回流30 min，放冷，转移至50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取木犀草苷对照品适量，精密称定，加2 mol/L盐酸甲醇溶液制成每1 mL含2.5 μg的溶液，即得对照品溶液。

图3 夜香牛茎横切面显微特征(×400)

图4 夜香牛薄层色谱图

图5 夜香牛高效液相色谱图

2.3.3 方法学考察

线性关系考察:精密量取对照品溶液(9.27 μg/mL)1，2，4，8，10 mL，置10 mL量瓶中，加2 mol/L盐酸甲醇溶液至刻度，摇匀，即得每 1 mL 含 0.927，1.854，3.708，7.416，9.270 μg 的系列溶液。分别精密吸取20 μL，注入液相色谱仪，依法测定，以对照品的质量浓度(μg/mL)为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y=76.32 X+0.0575，r=0.9998(n=5)。结果表明，木犀草苷质量浓度在0.927～9.270 μg/mL之间与峰面积线性关系良好。

重复性试验:取同一批供试品(批号为060301)溶液6份，依法测定。结果的 RSD为1.5%(n=6)，表明方法重复性良好。

稳定性试验:取同一份供试品(批号为060301)溶液，分别在制备后 0，2，4，6，8，12 h 时进样测定。结果的 RSD 为 0.83%(n=6)，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

中间精密度试验:取同一批样品(批号为060301)6份，由A，B，C 3人分别在不同的时间用同一台设备，依法测定。结果的 RSD为0.46%，表明中间精密度良好。

回收率试验:取同一批(批号为060301，含量0.139 mg/g)已知含量的样品1 g各6份，分别精密加入对照品溶液(154.5 μg/mL)0.5，1.0，1.5 mL，平行操作 2 份，依法测定，计算回收率。结果见表 1。

2.3.4 样品含量测定

取不同样品，依法测定其中木犀草苷的含量。结果见表2。

3 讨论

TLC定性鉴别中，关于供试品溶液的制备，曾采用回流法，比较了水、70%乙醇、酸性乙醇3种溶剂，结果以水回流、加盐酸至酸性、用乙酸乙酯提取的效果较好;还比较了乙酸乙酯－丁酮－甲酸(10∶7∶1)、甲苯(水饱和)－乙酸乙酯 －甲酸(5∶4.5∶0.5)、甲苯 －乙酸乙酯－甲酸－水(6∶3∶1∶3)的上层溶液等3种展开剂，结果以最后一种的上层溶液展开效果较好;也比较了紫外光灯(365 nm)下观察，以1%三氯化铁试液与1%铁氰化钾试液(1∶1)混合溶液为显色剂两种方法，结果后一种的显色效果较好。

表1 木犀草苷回收率测定结果(n=6)

表2 样品含量测定结果

据文献记载，夜香牛全草显黄酮、酚类、氨基酸等化学反应[2]，从全草中可分离得香叶木素、木犀草素、木犀草素－7－O－葡萄糖苷等有抑菌和促进消化系统蠕动作用的成分。故根据其所含成分并参照2005年版《中国药典(一部)》中独一味胶囊的测定方法[4]，选择木犀草苷作为含量测定指标。在木犀草苷含量测定时，取木犀草素对照品的甲醇溶液(0.1 mg/mL)，在紫外分光光度计250～400 nm波长间扫描，结果在350.2 nm波长处有最大吸收，与文献[4]的测定波长(350 nm)基本一致，故以350 nm为测定波长。

关于含量测定时供试品溶液的制备条件选择，曾考察药材的乙酸乙酯、乙醇提取液，液相色谱均末见游离木犀草苷峰，而经酸水解后高效液相色谱可见游离木犀草苷峰，说明夜香牛的木犀草苷以不同的苷类形式存在，故需水解才能测定;比较了超声法及回流法，结果用超声法提取效果最佳;曾分别用不同量的水、甲醇、75%乙醇、乙醇洗脱，结果用100 mL以内的水洗涤，可除去大部分水溶性杂质且对被测成分无影响，用甲醇、75%乙醇、乙醇洗脱结果无明显差异，但以甲醇洗脱、弃去前15 mL再收集续洗液的效果稍优;曾分别将样品置水浴中回流15，30，45 min，结果水解30 min的效果较好;曾分别加入盐酸 4.5，9.0，11.0 mL 考察酸浓度，结果溶液中酸的浓度为2.5 mol/L时水解较适合。另外，曾对甲醇提取液不过柱直接水解，由于部分糖对测定有影响，结果回收率较低，故不宜采用。

[1]江苏新医学院.中药大辞典(上册)[M].上海:上海人民出版社，1977:916.

[2]《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编(上册)[M].北京:人民卫生出版社，1978:472.

[3]中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴(第四册)[M].北京:科学出版社，1987:402.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社，2005:541.