毒素诱导挥发物对紫茎泽兰致病菌孢子萌发和菌丝生长的影响

张红玉,杨 斌,何月秋

（1.贵州师范大学,贵州 贵阳550001；

2.西南林业大学云南省高校森林灾害预警与控制重点实验室,云南 昆明 650224；3.云南农业大学植物病理重点实验室,云南 昆明 650201）

①紫茎泽兰Eupatorium adenophorum英文俗名Crofton weed或Mistflower Eupatorium,是一种危害严重的世界性恶性杂草,与其他外来有害入侵植物一样,对全球生物多样性构成极大的威胁[1-2],并给我国农林畜牧业造成巨大的经济损失[3-5]。该杂草不仅能分泌克生物质化感抑制周围植物生长[6-7],而且其提取物具有抑菌活性[8-9],尤其对细菌和真菌的影响最大[10],因此许多病原微生物很难寄生在该杂草上,缺少自然控制因子是造成该杂草疯狂入侵和蔓延的重要原因。链格孢菌Alternaria alternata、泽兰尾孢Cercospora eupatorii等病原菌虽然能够引起紫茎泽兰叶斑病,但在大部分紫茎泽兰发生区,紫茎泽兰病害的发生率并不高[11-13]。如何提高致病菌对该杂草的控制作用,是防除这类恶性杂草需要解决的重要问题。

目前人们研究紫茎泽兰萃取物对病原真菌的影响,主要集中在对三七圆斑病Mycocentrospora acerina、葡萄炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、马铃薯晚疫病菌Phytophthora infestans、番茄灰霉菌Botrytis cinerea等病原真菌[8-10]的抑菌作用方面,而对紫茎泽兰致病菌的影响尚未报道。紫茎泽兰挥发性成分对其致病菌是否同样存在抑菌作用,在松针褐斑病菌毒素胁迫下紫茎泽兰挥发性成分是增强了抑菌作用,抑或有利于病原菌克服抑菌作用等问题尚不清楚,需要进一步的研究。试验以分离自紫茎泽兰罹病植株的2种致病菌（链格孢菌Alternariaalternata和拟盘多毛孢菌Pestalotiopsissp.）为供试菌株,研究了紫茎泽兰新鲜叶片挥发性成分对供试菌株的影响,以及松针褐斑病菌毒素胁迫下诱导产生的挥发性成分对这2种致病菌孢子萌发和菌丝生长的影响,探讨松针褐斑病菌毒素的胁迫作用是否有利于提高致病菌对紫茎泽兰的控制作用,以期为进一步探讨能否利用毒素与紫茎泽兰致病菌协同防除紫茎泽兰提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 仪器水蒸汽蒸馏提取器、真空旋转蒸发仪、气质联用仪（FINNIGAN TOP 8000/VOYAGER）。

1.2 供试材料

1）植物材料：供试用紫茎泽兰采自西南林业大学校园及附近。

2）供试菌株：拟盘多毛孢、链格孢菌分离自云南省楚雄紫溪山罹病紫茎泽兰叶片,保存于西南林业大学微生物室。松针褐斑病菌Lecanosticta acicola由西南林业大学微生物室提供,用于提取粗毒素。

1.3 试验方法

1.3.1松针褐斑病菌粗毒素的制备 参照杨斌等[14]的方法提取获得,用无菌水将毒素粗提物配制成2.5 mg/mL的溶液。

1.3.2紫茎泽兰挥发油的提取

1）材料初处理：自无病虫害的健康紫茎泽兰植株取生长均匀一致的叶片,自来水冲洗后以滤纸吸干水分,待用。

①紫茎泽兰新鲜叶片：称取130 g,待用。

②毒素胁迫下紫茎泽兰植株叶片：取一定量的紫茎泽兰植株,插于2.5 mg/mL毒素粗提液中,48 h后,采下叶片,剪碎称取130 g,待用。

2）紫茎泽兰挥发油的蒸馏萃取：将经过初处理的2种材料分别用同时蒸馏萃取法进行挥发油的提取,萃取溶剂为石油醚,把材料放入蒸馏萃取装置一端的500 mL圆底烧瓶中,用电热套加热；装置的另一端为盛25 mL石油醚的100 mL圆底烧瓶,在60℃下水浴加热[15],同时蒸馏萃取4 h,再蒸去石油醚,得到具有浓烈香味的浅黄色精油,收油率依次分别为0.20%和0.19%。将得到的挥发油进行GC-MS分析,分析测试条件为色谱柱：HP-5MS（60 m ×0.132 mm ×0.125 μ m）；载气：He；流速：1 mL/min；进样温度：240℃；接口温度：250℃；质谱扫描范围：35～455 amu；离子源：EI源；电子能量：70 eV。

1.3.3挥发油对供试菌株影响的测定

1）供试菌种的培养：将拟盘多毛孢和链格孢菌的菌丝块移植于PDA培养基上,置于22℃培养5～7 d,取一部分用无菌水轻轻将孢子洗下,摇匀,制成孢子悬浮液,浓度为105个/mL。另一部分用于菌丝生长试验。

2）挥发油培养液制备：向PD培养液中加入少量的经过细菌过滤器过滤的精油,使体积分数分别为0.1%、0.5%和1%。以加入新鲜叶片挥发油的PD培养液为处理1,以加入毒素诱导挥发油PD培养液为处理2,以不含精油的PD培养液为对照。

3）生物活性测定：

①用悬滴法测定对孢子萌发的影响：在盖玻片上加1滴不同体积分数的精油培养液,作为孢子萌发的培养液,将少量孢子悬浮液放在盖玻片上的培养液中（悬滴液中孢子不宜太多）,将盖玻片翻转盖在载玻片凹陷处（在载玻片凹陷四周涂一层凡士林,以防止水分蒸发）,然后将载玻片放在有湿润滤纸的培养皿中,28℃恒温箱中保湿培养,12、24、36、48、60 h 后镜检孢子萌发数 。每一处理测定10组,试验重复3次,结果取其平均值。孢子萌发标准为芽管长至超过孢子短径的一半。孢子萌发率计算公式为：

②用干质量测定法测定菌丝生长量的变化：取不同体积分数的挥发油培养液各100 mL置于三角瓶中,接入少量病原菌菌丝,振荡培养24、48、72、96 、120 h 后,摇匀,各倒出 10 mL 于有双层滤纸的培养皿中（滤纸连同培养皿已干燥）,放入80℃的恒温箱中烘干（24 h）至恒质量,然后在天平上称量再减去培养皿和干燥滤纸的质量,即得到每10 mL培养液所含菌丝的干质量,经换算,菌丝干质量的单位为mg/mL。每一处理测定10组,试验重复3次,结果取其平均值。

1.3.4数据统计分析 采用SPSS软件进行方差分析及显著性检验。

2 结果与分析

2.1 毒素胁迫离体/活体叶片挥发性成分的变化采用蒸馏萃取法进行紫茎泽兰叶片挥发性成分的提取,并经GC-MS分析,结果表明,紫茎泽兰新鲜叶片中有39个挥发性成分,相对含量较高的为α-红没药醇（7.19%）、1,7,7-三甲基-二环庚-2-乙酸乙酯（4.85%）、八氢-7-甲基-3-亚甲基-4-（1-甲基乙基）-1H-环戊二烯-环丙基苯（2.98%）。毒素胁迫紫茎泽兰植株活体叶片中有54个挥发性成分,主要成分为乙酸冰片酯（5.16%）、α-红没 药醇（5.08%）、大 根香叶烯（3.68%）。说明松针褐斑病菌毒素胁迫可诱导紫茎泽兰叶片产生更多挥发性物质,且挥发油主要成分及含量较非胁迫状态明显不同。

2.2 挥发油培养液对供试病原菌孢子萌发的影响与对照相比,紫茎泽兰新鲜叶片挥发油对2种供试的紫茎泽兰病原菌孢子萌发不仅没有抑菌作用,相反,还能够显著地促进孢子萌发（P＜0.05）。培养60 h后,在新鲜叶片挥发油营养液中,拟盘多毛孢菌孢子萌发率为对照的1.7倍,链格孢菌孢子萌发率为对照的1～1.5倍。

与新鲜叶片相比,毒素诱导挥发油培养液对孢子萌发的促进作用更强（P＜0.05）。拟盘多毛孢菌在培养60 h后,处理2孢子萌发率最高可达59%,处理1为50%,对照为30%。链格孢菌孢子萌发率较拟盘多毛孢低,培养60 h后,处理1、处理2、对照孢子萌发率分别达20%、23%、13%（表1）。可见,无论是紫茎泽兰新鲜叶片还是毒素诱导挥发油均对2种供试菌的孢子萌发有非常显著的促进作用（P＜0.01）,而且后者的促进作用更强。说明毒素胁迫所诱导产生的紫茎泽兰挥发性成分十分有利于2种供试菌的孢子萌发。但随着挥发油体积分数的增加,对孢子萌发的促进作用并未呈现成正增长趋势。

2.3 挥发性成分营养液对供试病原菌菌丝生长的影响对于拟盘多毛孢而言,与对照相比,无论处理1还是处理2均对菌丝生长表现出抑制（P＜0.05）,且处理2抑制作用更强。培养72 h后,对照平均菌丝干质量可达3.21 mg/mL,而处理1中需培养96 h,在处理2中需培养120 h,菌丝干质量才能达到此值；培养120 h后,与对照相比,处理1和处理2对菌丝生长的抑制率均可达70%左右（表1）。

表1 挥发性成分对病原真菌孢子萌发和菌丝生长的影响

试验过程中发现,链格孢菌在PD培养液中菌丝生长十分缓慢,但挥发油能够明显促进菌丝生长。处理1和处理2仅培养24 h,平均菌丝干质量已分别为1.91～3.03、2.72～2.82 mg/mL,而对照培养120 h后的平均菌丝干质量仅为2.47 mg/mL（表1）。在挥发油营养液中培养72 h时,菌丝生长骤增,处理1和处理2中菌丝干质量分别可达对照的 8.4倍、8.7倍；此后,随着培养时间的增加,菌丝生长量增幅略微减弱,但培养120 h后,仍然分别可达对照的7.3倍、6.8倍。可见,无论鲜叶挥发成分还是毒素诱导挥发成分均能极显著地促进链格孢菌的菌丝生长（P＜0.01）,且后者促进作用更强。

3 讨论

已往研究表明紫茎泽兰挥发物有抑菌活性[10],本试验通过GC-MS分析,表明松针褐斑病菌粗毒素胁迫可诱导紫茎泽兰产生种类更丰富的挥发性成分,这些成分中的确不乏抑菌（或抑虫）活性成分,如大根香叶烯对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌具有显著的抑制作用[16],柠檬烯对很多细菌和真菌都具有较强的抗菌活性[17],乙酸冰片酯对马铃薯叶甲Leptinotarsa decemlineata具有较强的忌避作用等[18]。但本试验研究结果也表明,毒素诱导产生的挥发性成分并没有单纯地仅表现出抑菌活性（如抑制拟盘多毛孢菌的菌丝生长）,相反,对紫茎泽兰致病菌链格孢菌的孢子萌发和菌丝生长,以及拟盘多毛孢的孢子萌发,均表现出促进作用。换言之,毒素诱导产生的挥发性成分对不同的病原微生物,及其不同的生长阶段（如孢子萌发阶段或菌丝生长阶段）的影响是不同的,不能简单地划定抑菌与否。更为有趣的是,这是致病菌本身经过长期与紫茎泽兰协同进化而产生了适应能力的结果,还是毒素诱导产生的挥发性成分可能对某些病原微生物有抑制作用但对致病菌例外?一种可能的情况是,在毒素胁迫诱导紫茎泽兰产生了大量的种类更丰富的挥发性成分,一方面,这些成分可能对某些病原微生物有抑制作用,但对致病菌起不到抑菌效果；另一方面则因此造成紫茎泽兰自身物质的大量消耗,对致病菌的防御能力可能反而降低。从这个角度而言,松针褐斑病菌毒素胁迫可能有利于促进紫茎泽兰感病。至少有一点是可以肯定的,毒素胁迫诱导紫茎泽兰产生的挥发性成分不论是有利于致病菌的孢子萌发,还是有利于其菌丝生长,最终都会影响到紫茎泽兰病害的发生与发展。

当然,病害的发生发展是多因子共同作用的结果,单因子试验不能完全模拟,松针褐斑病菌毒素胁迫对于紫茎泽兰病害最终表现出促进还是抑制,还需要进一步通过接种试验来验证。在众多的挥发性成分中,究竟是哪一种成分有利于紫茎泽兰感病,也需要进一步深入研究。但如果仅从毒素-病原菌协同作用的角度来看,该毒素能够与紫茎泽兰致病菌（尤其是链格孢菌）协同作用,共同提高对紫茎泽兰的除草效果。至于二者协同除控紫茎泽兰的实际生防效果如何,仍需进行大量的实体接种试验和田间防治试验。

另外,由于松针褐斑病菌本身并不是紫茎泽兰的致病菌,因此该菌产生的毒素与紫茎泽兰病原菌协同作用,不仅可以增强紫茎泽兰致病菌的生防效果,而且由于该毒素与紫茎泽兰致病菌两者对紫茎泽兰的作用位点不同,较之致病菌与其自身分泌毒素的协同作用,能够更有效地延缓或阻止紫茎泽兰产生抗性生物型。

4 结论

综上所述,受松针褐斑病菌毒素胁迫后,紫茎泽兰挥发性成分对紫茎泽兰致病菌链格孢菌的孢子萌发和菌丝生长,以及拟盘多毛孢菌的孢子萌发有明显的促进作用,这种促进作用强于紫茎泽兰鲜叶挥发性成分；但诱导挥发性成分明显抑制拟盘多毛孢菌的菌丝生长,且抑制作用超过鲜叶挥发性成分。从毒素—致病菌协同防除紫茎泽兰的角度来看,该毒素胁迫有利于提高致病菌对紫茎泽兰的控制作用。因此,研究结果可为利用毒素-致病菌共同作用,促紫茎泽兰感病,为防除紫茎泽兰提供理论基础。

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