优化超声-微波协同提取葎草总黄酮的工艺研究

董江涛，李 燕，蒋橙华，徐慧强

（上海海洋大学食品学院，上海201306）

葎草（Humulus scandens（Lour）Merr）又名乌爪龙、拉拉藤、过肤龙等，为桑科葎草属草本植物[1]，野生于路旁、田边、林地、草地、果园等处，通常群生，生命力强，广泛分布于我国大部分地区[2]。由于其盘绕植株蔓延，且生长迅速，影响农作物的生长，被视为害草而未被重用。它具有清热解毒、消肿、利尿功效，有抗革兰氏阳性细菌的作用；而且营养丰富，可作蔬菜、饲料[3]。现代药理研究证明，葎草具有抗菌、抗炎、止泻[4]、抑菌、降压、镇痛等作用。已有报道表明，从葎草全草中分离出的主成分为黄酮类化合物[5]。但是，葎草黄酮的提取鲜有报道，并且提取得率差别很大。本研究期望通过响应曲面法的优化，在获得较高提取得率的同时，测定出葎草中黄酮的含量。

微波提取具有高效、节能、快速、提取率高的优点，但微波容易造成溶液受热不均。而超声波振动的空化效应使得样品介质各点受热一致[6]，并且不破坏物质本身的结构，则超声-微波联合提取，发挥了二者优点的同时又弥补了各自的不足，从而提高了活性物质的提取得率[7]。

本试验以黄酮的提取得率为指标，对各主要影响因子——微波功率、超声功率和超声时间/间隔时间的单一和交互作用等进行较深入的研究，应用响应曲面法对微波提取葎草黄酮的条件进行优化，得出微波辅助提取的最佳工艺参数，为以后的研究提供一定参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

葎草，11月中旬采自安徽亳州，自然晾干；芦丁标准品，由中国药品生物制品检定所提供；无水乙醇，NaNO2，Al（NO3）3，NaOH均为分析纯。

1.2 仪器与设备

WFZ-UV2000紫外可见分光光度计（尤尼柯仪器有限公司）；XH-300A祥鹄电脑微波-超声波组合合成萃取仪（北京祥鹄高科技发展有限公司）；sartorius BS210S电子天平（北京塞多利斯天平有限公司）；多功能粉碎机（广东佛山市方胜电器有限公司）；H2050R-1高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；微量移液枪（德国eppendorf公司）。

1.3 方法

1.3.1 制备提取液 取已干燥的葎草粉碎，过0.84 mm筛，准确称取1.0 g，加入60%乙醇，超声-微波协同辅助提取。提取液经抽滤、离心后于50 mL容量瓶中用60%乙醇定容，摇匀待用。1.3.2 制作芦丁标准曲线 准确称取0.010 0 g芦丁标准品放入小烧杯中，加60%的乙醇溶解，定容到50 mL容量瓶中，摇匀，得到0.200 mg/mL的芦丁标准液。分别移取 0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 mL的芦丁标准液于8个25 mL容量瓶中，各加1.0 mL 5%的NaNO2溶液，摇匀，静置6 min。再各加1.0 mL 10%的Al（NO3）3溶液，摇匀，静置6 min。继续各加入10 mL 4%的NaOH溶液，用60%的乙醇稀释到刻度，静置15 min。在波长510 nm处测定吸光度（A），以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标，A为纵坐标作标准曲线[8]。

1.3.3 总黄酮含量测定与计算 黄酮含量测定采用硝酸铝络合分光光度法，其原理是先用亚硝酸钠还原黄酮，再加硝酸铝络合生成稳定的红橙色化合物，于510 nm（符合定量分析的比尔定律）波长处测定吸光值，通过标准曲线计算黄酮含量。

准确移取1.0 mL的样品液于50 mL容量瓶中，加1.0 mL 5%的NaNO2溶液，摇匀，静置6 min；再加1.0 mL 10%的Al（NO3）3溶液，摇匀，静置6 min；最后加入10 mL4%的NaOH溶液，用60%的乙醇稀释到刻度，静置15 min。在510 nm处测定吸光度。根据标准曲线换算，按以下公式计算总黄酮得率。

1.3.4 单因素试验设计 分别考察了微波功率、超声波功率和提取时间3个因素在各自5个水平上的提取得率，及超声时间/间隔时间在1/2，2/1，1/0水平上的提取得率。具体参数列于表1。

表1 单因素试验考察因素及水平

1.3.4.1 微波功率对提取得率的影响 在液料比20∶1、乙醇浓度60%、提取时间20 min、超声功率为600 W、超声时间/间隔时间为1/0的条件下，考察微波功率对葎草黄酮提取得率的影响。

1.3.4.2 超声波功率对提取得率的影响 在液料比20∶1、乙醇浓度60%、微波功率420 W、提取时间20 min、超声时间/间隔时间1/0的条件下，考察超声波功率对葎草黄酮提取得率的影响。

1.3.4.3 提取时间对提取得率的影响 在液料比20∶1、乙醇浓度60%、微波功率420 W、超声功率为600 W、超声时间/间隔时间1/0的条件下，考察提取时间对葎草黄酮提取得率的影响。

1.3.4.4 超声时间/间隔时间对提取得率的影响

在液料比20∶1、乙醇浓度60%、微波功率为420 W、超声功率为600 W、提取时间为20 min的条件下，考察超声时间/间隔时间对葎草黄酮提取得率的影响。

1.3.5 响应曲面设计 在单因素试验结果基础上，综合考虑超声功率、微波功率和超声时间/间隔时间3个因素对葎草总黄酮提取得率的影响，采用Box-Behnken设计方案做响应曲面研究，建立了葎草黄酮提取得率的二次多项式数学模型。3个自变量超声功率、微波功率和超声时间 /间隔时间分别以 X1，X2和 X3代表，以 +1，0，-1分别代表各自的不同水平。编码因素及水平、试验设计方案如表2所示。

表2 响应面法分析因素及水平

2 结果与分析

2.1 标准曲线

从图1可以看出，芦丁标准曲线回归方程为：A=9.412 2C－0.005 4（R2=0.999 7），其中，C 为黄酮浓度（mg/mL），A为吸光度，线性关系良好。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 微波功率对提取得率的影响 由图2可知，在较低的微波功率条件下，黄酮的提取得率随微波功率的增强而显著增加，但微波功率大于420 W后，黄酮提取得率会降低，这是因为过高的微波功率会促使黄酮类物质氧化，使得总黄酮的提取得率降低。

2.2.2 超声波功率对提取得率的影响 由图3可知，在400～600 W的超声波功率条件下，黄酮的提取得率随超声波功率的增强而显著增加，超声波功率达到600 W时达到极大值，是由于超声的“空化效应”和“机械效应”使细胞结构破坏，黄酮类物质易溶出；之后黄酮提取得率随超声功率的增加而降低，这或许是因为较高的超声功率破坏了黄酮物质的结构。

2.2.3 提取时间对提取得率的影响 由图4可知，在5～20 min内，随着提取时间的延长，总黄酮得率呈直线上升，在20 min时，黄酮提取得率达到最大值，之后开始下降。其原因是浸提开始时，葎草与溶剂接触充分，黄酮能够充分溶解，但随着时间的延长，会有部分黄酮类物质被氧化以及结构遭到破坏，使得黄酮提取得率降低，因此，选择20 min为葎草黄酮提取的较佳时间。

2.2.4 超声时间/间隔时间对提取得率的影响由图5可知，黄酮提取得率随着超声时间/间隔时间的增大而增加，当连续超声时间达到极大值时，说明连续超声的作用大于间歇性的作用。这是因为连续的超声作用使黄酮类物质的溶解呈持续增加的现象，因此选择连续超声提取。

2.3 响应曲面优化试验

2.3.1 模型建立及显著性检验 响应曲面设计试验中，以超声波功率、微波功率、超声时间/间隔时间为参数，葎草黄酮的提取得率为响应值，进行了3因素3水平响应曲面分析试验（表3）。

由表3可知，试验值与预测值很接近，模型适应性高。利用Design Expert 7.0.0软件对数据进行二次多元回归拟合，得到葎草黄酮提取得率（Y）对编码自变量超声功率（X1）、微波功率（X2）和超声时间/间隔时间（X3）之间的二次多项回归方程：

模型的回归方程系数及显著性检验列于表4。

表3 响应曲面试验结果

表4 回归方程系数及显著性检验

从表4黄酮得率回归模型方差分析可以看出，F回=49.33＞F0.01（9.4）=14.8，P＜0.000 1，表明模型显著。黄酮得率F失拟=0.50＜F0.05（9.3）=8.81，失拟项P=0.70＞0.05，表明失拟不显著。模型一次项超声功率X1（P=0.000 3）、微波功率X2（P=0.001 2）、超声时间/间隔时间X3（P=0.006 4）显著；二次项均显著；交互项：超声功率与微波功率X1X2（P=0.005 8）、超声功率与超声时间/间隔时间X1X3（P=0.001 2）显著，微波功率与超声时间/间隔时间X2X3（P=0.271 8）不显著。

用Design Expert软件中Box-Behnken法计算葎草黄酮得率回归模型的调整确定系数（Ad-jR-squared）=0.964 5， 即该模型能解释96.45%响应值的变化，模型拟合程度良好，试验误差小，说明应用响应曲面法优化的提取条件提取葎草总黄酮是可行的。

2.3.2 响应曲面分析 利用Design Expert 7.0.0软件对表2数据进行二次多元回归拟合，得到的二次回归方程的等高线及其响应面如图6～8所示。通过二次模型所得到的等高线及响应曲面形状来判断试验因素之间的交互作用强度，以及确定各因素的最佳水平范围。

由图6可知，当提取时间、超声时间/间隔时间固定、超声功率不变的条件下，微波功率在400～420 W范围内增大时，曲线较陡，葎草黄酮提取得率急剧增加，在420 W附近达到极大值而后缓慢降低，曲率变化明显，与单因素试验结果相吻合。

由图7可知，微波功率、超声时间/间隔时间不变的条件下，固定提取时间，曲线呈现陡峭增加，曲率变化明显，达到极大值后呈现平滑递减的规律，说明超声功率在较低的水平下对葎草黄酮提取得率影响大于较高水平下的影响。

由图8可知，微波功率、提取时间不变的条件下，固定提取时间和超声功率，葎草黄酮提取得率随着超声时间/间隔时间的升高先增加后降低，在1/0时达到极大值，说明连续超声的作用大于间断性的超声作用，呈较陡的曲线。

响应曲面坡度可反映响应值对因素变化的敏感性，等高线的形状可反映交互作用的强弱[9-10]。从图6～8可以看出，响应面陡峭，说明提取得率对微波功率、超声波功率和超声时间/间隔时间的变化敏感；等高线呈椭圆，说明超声功率和超声时间/间隔时间、超声功率和微波功率之间交互影响显著。

对回归方程求导，并令其等于零，可以得到曲面的最大点，即3个主要因素的最佳水平值，转换后得到提取的最佳条件为：微波功率424.590 W、超声功率624.000 W、超声时间/间隔时间1/0，此条件下葎草总黄酮的得率达1.899%，得率较高。

2.4 模型验证

对试验进行验证，选择的条件为：超声功率620 W、微波功率420 W、超声时间/间隔时间1/0、提取时间20 min、液料比20∶1，黄酮的得率分别为 1.78%，1.83%，1.85%，1.80%，1.83%，重复性较好，平均为1.82%，偏差不大，数据重现性良好。吸光度测量值稳定，说明每次的提取液中黄酮含量比较接近，证明该结果是合理可靠的。

3 结论

为了比较响应曲面法相对正交优化的优势，将响应曲面法用于分析优化葎草总黄酮的提取条件，经优化后的葎草总黄酮得率可保持在1.8%以上的水平，说明响应曲面法能更好地反应各因素之间的相互作用，是一种比较好的优化工艺的方法。

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