Real-time PCR方法检测肉品中的沙门氏菌

方 平，杨永莉，杨 宝，王晓闻

（山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷030801）

在我国，沙门氏菌污染引起的食物中毒占食源性疾病中细菌食物中毒病例的70%～80%[1]，且WHO已将沙门氏菌列入具有严重为害和中等为害的食物传播性病原[2]。而沙门氏菌常规检测方法和普通PCR方法的灵敏度及检测所需要的时间还有待于进一步提高。

本研究用普通PCR方法检测引物对沙门氏菌的特异性，并用SYBR Green I作为荧光染料，拟用Real-time PCR方法检测熟制牛肉和香肠中沙门氏菌，以建立一种检测肉品中沙门氏菌速度快、灵敏度高的方法。

1 材料和方法

1.1 主要材料与试剂

试验样品：熟制牛肉（市售）、香肠（市售）。

试验菌株：沙门氏菌和非沙门氏菌标准菌株各10株（表1）。

SYBR Green I，dNTP，buffer，Taq 酶等均购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA Ladder购自天根生物（北京）有限公司。

1.2 主要仪器与设备

DYY-6C电泳仪（北京市六一仪器厂），Mx3000P荧光定量PCR仪（Stratagene公司，美国），Scientz-04无菌匀浆器（宁波新芝生物科技股份有限公司），WFH-201BJ紫外可见透射反射仪（上海精科实业有限公司）。

1.3 引物的选择与合成

本试验选用Wang等[3]报道的fimI基因序列中的1对引物，其序列如下。

上游引物为 5′-CCTTT CTCCA TCGTC CTGAA-3′；下游引物为5′-TGGTG TTATC TGCCT GACC-3′。这对引物可扩增沙门氏菌fimI基因中1段大小为85 bp的序列，引物由北 京奥科生物技术有限公司合成。

表1 试验所用菌株

1.4 样品的前处理

取过夜培养的鼠伤寒沙门氏菌的营养肉汤增菌液，按10倍梯度进行稀释，分别取10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，10-10的 稀释液1 mL于25 g无菌操作剪碎的肉沫中，同时选3个稀释梯度的稀释液，吸取1 mL进行沙门氏菌的菌落记数，分别作3个平行样品，同时作空白对照组，并用常规检测沙门氏菌的方法检测原肉品作对照。将已加菌液的肉沫加入225 mL的无菌生理盐水，置于500 mL的三角瓶中，进行无菌操作匀浆，然后分别吸取1 mL匀浆液进行菌落记数，同时吸取1 mL用于提取DNA。将剩余的菌液置于37℃下振荡培养，每隔1 h吸取1 mL匀浆液提取DNA。如此操作，每个稀释梯度的样品进行6次DNA的提取试验。

1.5 反应模板的制备

关于沙门氏菌DNA的制备方法有许多介绍[4]，本试验依据《分子生物学实验指导》中的经典分子生物学细菌总DNA提取方法[5]进行。

提取熟制牛肉中的沙门氏菌DNA的步骤如下[6-7]。（1）将沙门氏菌标准菌株接种于营养肉汤培养基中，37℃培养18 h，取细菌培养液1 mL于Eppendorf管中离心，弃去上清液。（2）沉淀中加入567 μL TE缓冲液，用吸管反复吹打沉淀，使之重新悬浮；加入30 μL10%SDS和3 μL20 mg/mL的蛋白酶K溶液，混匀，37℃温育1 h。（3）取上清液加等体积氯仿/异戊醇混合液（体积比为24∶1）摇匀，冰浴 10 min，14 000 r/min离心5 min。取上清液，加等体积酚/氯仿/异戊醇混合液（体积比为25∶24∶1）摇匀，冰浴10 min，14 000 r/min离心5 min，取上清液。（4）将上清液转移到另一新的离心管中（约200 μL），加入2倍体积预冷的无水乙醇（400 μL），置于-20℃冰冻1 h或过夜。（5）14 000 r/min低温高速离心15 min，弃去上清液，离心管倒置，风干，用30 μLTE缓冲液溶解，于-20℃冰箱放置备用。

以牛肉中的沙门氏菌DNA的提取方法为基础提取香肠中沙门氏菌DNA时，由于香肠中加入了许多淀粉、调味料等多种成分配料，使得DNA模板的提取难度增加。在1.5中（1）～（3）步骤后，如果上清液不能顺利地完成，可以再重复步骤（3）的操作，同时，在步骤（3）后，再加一步丙三醇清洗来提高DNA模板的沉淀。

1.6 PCR反应体系和参数[8]

Real-time PCR反应体系的总体积为25 μL，包括 SYBR Premix Ex TaqTM（2×）12.5 μL，Rox Reference Dye Ⅱ 0.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 0.7 μL，DNA 模板 5.0 μL，ddH2O 5.6 μL。并按此顺序加样。用5 μL的ddH2O代替DNA模板作空白对照组。

Real-time PCR反应的条件为：95℃预变性30 s；95 ℃变性 5 s，55 ℃退火 15 s，72 ℃延伸10 s，40 个循环；72 ℃保温 1 min。

2 结果与分析

2.1 沙门氏菌引物的特异性试验

分别吸取沙门氏菌和非沙门氏菌标准菌株的DNA提取液6 μL作为模板，进行PCR扩增，

2.2 食品样品中沙门氏菌的检测

对经国标（GB/T 4789.4—2003）和普通PCR方法检测都确认是沙门氏菌阴性的食品样品，再用Real-time PCR方法进行检测，记录扩增曲线和熔解曲线。同时，用鼠伤寒沙门氏菌的增菌液吸取扩增产物5 μL进行电泳。由图1，2可知，引物对沙门氏菌扩增产物的条带清晰明亮，没有拖尾和非特异性带，而对非沙门氏菌扩增产物无条带，与空白对照组效果一样。因此，引物对沙门氏菌具有较强的特异性。按1.4的步骤作阳性对照。

2.2.1 市售熟制牛肉中沙门氏菌的检测 对人工加入不同稀释度菌液的牛肉进行平板计数及Real-time PCR检测，结果如图3，4所示。

图3的熔解曲线中，阳性对照为鼠伤寒沙门氏菌。从图3可以看出，牛肉中沙门氏菌浓度从1.3×107cfu/25 g到13 cfu/25 g均呈现一个典型的熔解峰，并且其熔解峰与阳性对照一致，扩增目标基因的熔点值Tm为85.602℃，说明Realtime PCR方法检出的是沙门氏菌而非其他菌株，检测结果为沙门氏菌阳性。同时，空白对照和沙门氏菌量少到2 cfu/25 g时，均未出现特异性的熔解峰，检测结果为阴性。

扩增曲线如图4所示，曲线拐点清楚，标准的基线平直，无明显的上扬趋势，表明各反应管的扩增效率相近，扩增比较好。由图4可知，牛肉中沙门氏菌浓度从1.3×107cfu/25 g依次减少至13 cfu/25 g，扩增曲线的Ct值依次增加且都小于40，而2 cfu/25 g和空白对照组的扩增曲线与标准基线重复，即Ct值均为0，可见SYBR Green I Real-time PCR方法检测牛肉中的沙门氏菌的检出限为13 cfu/25 g。

由表2可知，用常规PCR方法检测市售熟制牛肉中沙门氏菌的灵敏度为128 cfu/25 g，而用Real-time PCR方法检测的灵敏度为13 cfu/25 g，灵敏度明显高于常规PCR检测方法。

表2 SYBR GreenⅠReal-time PCR与常规PCR的比较

2.2.2 市售香肠中沙门氏菌的检测 对人工加入不同稀释度菌液的香肠同时进行平板计数及Real-time PCR检测。结果如图5，6所示。

图5的熔解曲线中，阳性对照为鼠伤寒沙门氏菌。从图5可以看出，香肠中的沙门氏菌浓度从1.2×107cfu/25 g到12 cfu/25 g均呈现出一个明显的熔解峰，并且其熔解峰与阳性对照一致，扩增目标基因的熔点值Tm为85.602℃，说明SYBR Green I Real-time PCR方法检出的是沙门氏菌而非其他菌株，检测结果为沙门氏菌阳性，其特异性比较强。同时，空白对照和鼠伤寒沙门氏菌量少到1 cfu/25 g时，均未出现特异性的熔解峰，说明检测结果为阴性。

扩增曲线（图6）中，样品曲线与阳性对照的曲线整体平行性较好，曲线拐点清楚，标准的基线平直，无上扬趋势，说明各反应管的平等性好，扩增效果比较好。由图6可知，香肠中的鼠伤寒沙门氏菌浓度从1.2×107cfu/25 g依次减少至12 cfu/25 g，扩增曲线的Ct值逐渐增加且都小于40，而1 cfu/25 g和空白对照组的Ct值均为0，所以SYBR Green I Real-time PCR方法检测香肠中的沙门氏菌的检出限为12 cfu/25 g。

从表3可以看出，用常规PCR方法检测市售香肠中沙门氏菌的灵敏度为116 cfu/25 g，而用Real-time PCR方法检测市售香肠中沙门氏菌的灵敏度为12 cfu/25 g，灵敏度明显高于常规PCR检测方法。

表3 SYBR Green I Real-time PCR与常规PCR的比较

2.3 可重复性试验

为验证Real-time PCR方法的可重复性，以同一浓度的鼠伤寒沙门氏菌DNA为模板，做3个重复，分别进行同条件的扩增。结果（图7）显示，3个样品的扩增曲线基本吻合，3次扩增曲线的 Ct值分别为 28.56，28.39，28.41。经计算，3 次扩增曲线Ct值的标准差为0.093，变异系数CV（coefficient of variation）为0.33%。而一般荧光PCR仪的Ct值重复性误差在CV≤2.1%范围内就可以[9]，可见，本试验所研究的Real-time PCR方法具有较高的可重复性，从而保证了不同样品间检测结果的可靠性和稳定性。

2.4 抗干扰性试验

在食品样品中接种少量的鼠伤寒沙门氏菌菌液，再分别接种大肠埃希氏菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌等（接种量大于沙门氏菌），另外，作一组只接种相同量的沙门氏菌样品为对照，用Real-time PCR方法进行检测。经试验，接种杂菌的待检样品中的沙门氏菌含量达到Real-time PCR方法的检测灵敏度，因此，该方法不受其他杂菌的影响。

3 讨论

Real-time PCR方法在普通PCR基础上，增加了SYBR Green I荧光染料，在PCR扩增的同时检测其荧光强度，可大大提高检测的灵敏度。Real-time PCR方法采用完全封闭的管和荧光染料同步检测，省略了PCR产物的电泳和紫外灯下观测等步骤，简化了检测过程，节省了检测时间。Real-time PCR方法还比较安全，整个体系中不包含EB等有毒物质，对环境的污染和人体的危害很小。本试验建立了针对沙门氏菌的Realtime PCR检测方法，其检测时间（不包括增菌和前处理）仅需1.5 h。因此，该检测方法快速、灵敏、稳定，且操作简便，易于掌握[10-11]。

Real-time PCR具有上述诸多优点的同时，也存在一些不足之处。如Real-time PCR方法运用了封闭的检测，减少了扩增后电泳的检测步骤，因此也就不能监测扩增产物的大小[12]（本试验先用普通PCR检测，知道其扩增产物的大小，再用Real-time PCR方法提高其检测的灵敏度，避免了这一不足之处）；荧光PCR仪价格较昂贵，从而限制了其广泛的应用；荧光染料见光易分解，需要避光保存等。另外，它的特异性完全依赖于引物，并不比常规的PCR具有更高的特异性；荧光信号的强弱依赖于双链DNA的质量而不是分子数[13]。在扩增效率相同的情况下，长扩增产物的信号要强于短扩增产物。如果扩增效率不同，那么定量会更不准确。从长远看，尤其是对于检测工作来说，荧光PCR技术将越来越得到广泛的应用，成为病原菌检测的主要技术之一。

［1］马立农.食品沙门氏菌PCR快速检测试剂盒简介[J].深圳职业技术学院学报，2005，4（2）：189-192.

［2］卢强，陈贵连，林万明.PCR扩增invA基因特异性检测沙门氏菌[J].中国兽医学报，1994，14（3）：251-255.

［3］Wang X W，Narayanan Jothikumar，Mansel W G.Enrichment and DNAExtraction Protocols for the Simultaneous Detection of Salmonella and Listeria monocytogenes in Raw Sausage Meat with Multiplex Real-Time PCR[J].Journal of Food Protection，2004，76（1）：189-192.

［4］薛俊龙，王采先，詹丽娥，等.两种物理方法破碎大肠杆菌比较试验[J].山西农业科学，2005，33（4）：77-79.

［5］刘进元.分子生物学实验指导[M].北京:清华大学出版社，2002.

［6］李景鹏，李成梅，丁乃峥，等.应用聚合酶反应快速检测沙门氏菌[J].东北农业大学学报，1997，28（1）：79-83.

［7］石晓路.沙门氏菌荧光PCR快速检测方法的建立与应用[D].武汉:华中农业大学，2003.

［8］温立斌，何孔旺，杨汉春，等.SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测类猪圆环病毒因子P1[J].华北农学报，2009，24（4）：31-35.

［9］张文超.聚合酶链反应（PCR）技术与基因扩增分析仪器（PCR 仪）[J].生命科学仪器，2005（3）：14-20.

［10］Eyigor A，Carli K T，Unal C B.Implementation of real-time PCR to tetrathionate broth enrichment step of Salmonella detection in poultry [J].Letters in Applied Microbiology，2002，34（1）：37-41.

［11］Hiroshi Fukushima，Yoshie Tsunomori，Ryotaro Seki.Duplex Real-Time SYBR Green PCR Assays for Detection of 17 Species of Food or Waterborne Pathogens in Stools[J].Journal ofClinical Microbiology，2003，11：5134-5146.

［12］张华，许叔祥.定量聚合酶链反应的研究进展与临床应用[J].中华检验医学杂志，2000，23（2）：120-121.

［13］蒋春燕，王泰健，王琴，等.实时荧光定量PCR技术[J].动物医学进展，2005，26（12）：97-100.