初诊2型糖尿病患者外周血内皮祖细胞的研究*

陈树春 宋光耀 孙 阳 马慧娟

大血管并发症是糖尿病的重要并发症，血管内皮功能失调在其发生、发展中起着关键作用。内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一类可特异性归巢于损伤区域，并能分化增殖为成熟内皮细胞的一群干/祖细胞，其定居于骨髓,可以动员到外周血,迁移、归巢到血管新生或损伤部位,并在靶区域增殖、分化为内皮细胞，从而修复受损的血管内皮。有学者认为可应用CD34+KDR+的EPCs计数来独立地预测心血管事件的发生[1]。本研究旨在探讨2型糖尿病（T2DM）患者内皮依赖性血管舒张功能及循环EPCs数量的变化,并进一步了解两者间关系以及炎症对其影响，以期为预防和治疗T2DM血管并发症的发生、发展提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2008年3月—6月我院门诊或住院初诊为T2DM患者35例,均符合1999年WHO T2DM诊断标准，均不伴有糖尿病视网膜病变、神经病变及血管病变。正常对照组20例，均为我院同期健康查体者，无糖尿病家族史，排除空腹血糖受损、糖耐量受损及糖尿病。所有入选者均排除高血压、冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）、脑血管病，无肝、肾功能障碍，所有受试者研究期间未应用任何药物。

1.2 方法

1.2.1 血管内皮功能的测定 根据Celermajer等[2]的方法采用二维超声成像扫描法分别测定受试者休息、反应性充血试验及含服硝酸甘油后的肱动脉内径，分别为D0、D1、D2。内皮依赖性血管舒张功能（EDV）＝（D1－D0）/D0×100%，非内皮依赖性血管舒张功能（EIV）＝（D2－D0）/D0×100%。以肱动脉内径扩张≥10%为血管内皮功能正常，＜10%为异常。所用仪器为美国通用公司PHILIPS HDI 5000型彩色超声诊断仪，探头频率7.0 MHz，探查深度4 cm。

1.2.2 各项生化指标的测定 所有受试者取血前24 h禁酒，停用所有药物，经过夜禁食12 h以上，第2天清晨取坐位，经肘正中静脉取血。采血4 mL离心测三酰甘油（TG）、胆固醇（TC）、空腹血糖（FBG）、餐后2 h血糖（2 h PBG）、胰岛素（FINS）、糖化血红蛋白（HbA1c）及超敏C反应蛋白（hsCRP）。然后检测体质量、体质指数（BMI）及血压。血脂用生化比色法，血糖测定用葡萄糖氧化酶法，胰岛素用放免法，hsCRP的测定采用散射比浊法，用李光伟等[3]的公式计算胰岛素敏感指数（IAI）来评估胰岛素抵抗（IR）。

1.2.3 外周血EPCs水平的测定 受试者清晨空腹采肘正中静脉血2 mL，肝素抗凝。加入FITC标记的CD34单克隆抗体（BD公司生产），加入PE标记的KDR（VEGFR－2）单克隆抗体（BD公司生产）对细胞进行标记，经孵育、洗涤后上机分析。采用BD公司的FACS Calibur流式细胞仪以CellQuest软件进行流式细胞分析。在前向角和侧向角散射光双参数点图上对淋巴细胞群设窗，共收集细胞10 000个，CD34和KDR双阳性（CD34＋/KDR＋）细胞数即为EPCs水平。

1.3 统计学处理 用SPSS 13.0统计软件进行统计处理，对所测定结果进行正态检验，空腹胰岛素（FINS）和呈偏态分布，取其自然对数转为正态分布后进行分析。组间均数比较用t检验或t′检验；率的比较采用χ2检验，多因素分析用多元线性回归。相关分析应用Pearson直线相关分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组临床指标比较2组年龄、性别差异无统计学意义（P>0.05）；T2DM组BMI、收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、TG、TC、FBG、HbA1c、hsCRP及FINS高于对照组（P<0.05），IAI显著低于对照组，差异有统计学意义（P<0.01），见表1。T2DM组的EDV水平及EPCs数量较对照组降低，差异有统计学意义（P<0.01），2组间EIV及基础内径比较差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

2.2 EDV水平与EPCs的关系T2DM组EDV与EPCs的数量呈正相关（r=0.430，P<0.05）。

表1 2组受试者临床和生化指标比较 （±s）

表1 2组受试者临床和生化指标比较 （±s）

*P＜0．05，**P＜0．01，表2同；1 mm Hg=0.133 kPa

对照组T2DM t、t′或 χ2 20 35性别（男/女）11/9 19/16 0.003年龄（岁）45.96±6.69 47.94±7.36 0.99 BMI（kg/m2）23.21±2.32 26.06±3.30 3.405 2**SBP（mm Hg）121.30±8.31 132.49±6.38 5.597 2**组别n DBP（mm Hg）74.37±5.40 81.34±8.15 3.804 8*FINS（mU/L）2.13±0.53 2.81±0.58 4.312 1**-3.79±0.57-4.65±0.64 4.982 1**TG(mmol/L)0.99±0.56 1.89±0.10 7.122 8*对照组T2DM t、t′或 χ2 20 35组别nIAI TC(mmol/L)4.41±1.04 5.21±1.10 2.670 8*FBG(mmol/L)5.19±0.67 8.73±2.35 8.338 5*2 h PBG(mmol/L)6.94±2.36 13.00±4.67 6.382 0*HbA1c(%)5.34±0.23 8.36±1.31 13.285 0*hsCRP(mg/L)7.42±0.13 10.68±0.31 54.403 5*对照组T2DM t、t′或 χ2 20 35组别n

表2 2组肱动脉内皮舒张功能及EPCs数量的比较（±s）

表2 2组肱动脉内皮舒张功能及EPCs数量的比较（±s）

组别对照组T2DM t或t′基础内径（%）3.49±0.51 3.56±0.50 0.495 9 EDV（%）10.45±3.21 2.62±0.26 10.888 3*EIV（%）13.76±2.31 15.58±6.81 1.442 5 EPCs 14.20±1.92 10.14±1.03 15.587 8**

2.3 多元回归分析 以EPCs数量作为因变量，将BMI、SBP、DBP、IAI、TC、TG、hsCRP、HbA1c作为自变量，进行逐步多元线性回归分析显示，hsCRP、IAI和HbA1c进入方程，方程式为赞=-0.096+0.216 X1-0.247 X2-2.113 X3（：EPCs数量；X1：lnIAI；X2：HbA1c；X3：hsCRP），复相关系数分别为0.324、0.279及0.310，均P<0.05。

3 讨论

糖尿病患者是动脉硬化和心血管疾病发生的高危人群。血管内皮是动脉硬化的“第一道防线”，血管内皮功能失调在动脉粥样硬化的发生、发展中起着关键作用，是心血管疾病的危险因素。内皮功能障碍可影响内皮功能的损伤及修复的动态平衡，EPCs是内皮修复的关键因素之一，在维持以上平衡中发挥着重要作用。

笔者前期研究显示，糖尿病的血管内皮功能失调出现在糖尿病诊断之前，且与IR、脂代谢异常及炎症因子相关[4]。本研究结果显示，排除药物、吸烟等影响，未治疗的初诊T2DM患者存在血糖升高、肥胖、脂代谢紊乱、IR以及血管内皮功能障碍，说明在初诊的糖尿病患者已经存在发生大血管并发症的危险。

内皮功能障碍是由内皮功能的损害和修复之间的动态平衡失调导致，EPCs可以直接分化成内皮细胞，也可以通过旁分泌血管生成因子，动员骨髓祖细胞和激活成熟内皮细胞[5]，使损伤的内皮得以修复，所以EPCs数量和功能下降会影响血管内皮损伤的修复，进而加重内皮功能损伤。本研究结果显示，初诊的T2DM患者存在EPCs数量下降，且EDV与EPCs的数量呈正相关，与Krankel等[6]的研究一致，进一步说明了EFCs对维持正常血管内皮功能的重要性。

本研究以EPCs数量作为因变量进行逐步多元回归分析表明，hsCRP、lnIAI和HbA1c进入方程，说明炎症、IR和长期高血糖是EPCs功能和数量的影响因素。有研究表明，健康者的EPCs在高糖条件下培养,其数量、产生一氧化氮（NO）的能力、迁移能力和成血管能力均下降[7]；高糖状态下造成的氧化应激可使EPCs的磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB/Akt）通路受阻，从而影响EPCs的分化、成血管能力和凋亡；高糖介导的FoxO转录因子磷酸化/乙酰化失衡可能使FoxO蛋白表达增加,上调前凋亡基因表达,介导EPCs凋亡，从而影响EPCs的功能和数量[8]。糖代谢紊乱的程度和时间长短与EPCs的数量及功能密切相关，即糖尿病时间越长、血糖越高，EPCs功能损害越重。糖尿病患者的EPCs功能变化在控制血糖后可以部分修复。胰岛素有可能通过胰岛素受体底物（IRS）和PI3K/Akt途径发挥双相作用，在生理浓度下磷酸化Akt可以导致内皮一氧化氮合酶（eNOS）磷酸化,增加NO释放，促进EPCs的功能，而在胰岛素抵抗时,高浓度胰岛素使IRS/PI32K/Akt通路受阻，损害EPCs的功能[9]。炎症对EPCs的数量和功能存在一定影响，CRP作为一个典型的炎症因子，可通过减少EPCs NOS表达而抑制EPCs的分化、存活和功能[10]，还可以使EPCs的活性氧（ROS）产生增加，降低细胞的端粒酶逆转录酶（TERT）活性，缩短端粒的长度，同时降低EPCs抗氧化酶的表达，上调了EPCs糖基化终产物受体（RAGE）的表达，促使EPCs的氧化应激而发生衰老和功能紊乱，进一步导致细胞凋亡增加[11-12]。

综上所述，未治疗的初诊T2DM患者存在与血糖控制、IR及炎症相关的血管内皮功能受损和EPCs数量及功能的下降，提示良好的血糖控制、改善胰岛素敏感性和炎症控制有益于干预糖尿病血管并发症的发生和发展。

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