大黄与活血、止血药配伍调控小鼠腹腔巨噬细胞增殖活性的研究*

李继坤，张艳萍，王 倩，薛小平，杨秀竹

（天津市中西医结合急腹症研究所，天津 300100）

复方中药是中医辨证施治的具体体现和实施方式，被认为是中医用药的精髓之一[1]。由于中药药效成分复杂，以及中药的多层次多靶点作用的特点,导致复方药物研究存在诸多难点[2-3]。虽然近年来中药配伍研究取得长足进步[3-4]，但是中药配伍之间的相互作用的筛查仍是一项浩繁的系统工程，目前还没有理想的实验方法。噻唑蓝比色分析方法（MCA）是一种简单准确、快捷的测定细胞活性的方法，广泛应用在细胞学研究领域[5]。本实验选用MCA测定方法对大黄与丹参、复方丹参、白及配伍对小鼠腹腔巨噬细胞增殖活性进行了初步实验研究。

1 材料与方法

1.1 主要材料 动物：清洁级Balb/c小鼠，雌雄兼用（军科院实验动物中心提供）。主要试剂：DMEM营养液，胎牛血清（Life Technologies，Inc.）；硫基乙醇酸盐（中国药品生物制品检定所）；噻唑蓝（MTT）、L－谷胺酰胺（GIBCO产品）。主要仪器：二氧化碳孵育箱（series 5400美国NAP－CO）；全自动酶标仪（2010型，奥地利TECAN公司）；细胞培养用显微镜（CK400）。实验用药：大黄水煎剂、白及水煎剂（由天津市中西医结合急腹症研究所药物研究室提供，每毫升相当于生药1 g）；丹参粉针剂（哈药集团中药二厂提供。国药准字：Z10970093；批号：070123；400 g/L）；复方丹参注射剂（上海第九制药厂提供，国药准字：Z13021388；批号：070512；每毫升相当于生药 2 g）。

1.2 实验药物配制及分组 大黄及白及水煎剂用0.22滤膜过滤除菌，选用营养液配成3种浓度（高浓度为：100 g/L；中浓度为：10 g/L；低浓度为：1 g/L）的应用药液备用。丹参粉针剂（高浓度为：400 g/L；中浓度为：4 g/L；低浓度为：4 g/L）、复方丹参注射剂（高浓度为：200 g/L；中浓度为：20 g/L；低浓度为：2 g/L）两种药物同样用营养液配制备用，调pH值至7.2～7.4之间。

实验分组：A组：大黄水煎剂组；B组：白及水煎剂组；C组：丹参粉针剂组；D组：复方丹参注射剂组；E 组：大黄水煎剂加白及水煎剂组（1∶1）；F 组：大黄水煎剂加丹参粉针剂组（1∶1）；G组：大黄水煎剂加复方丹参注射剂组（1∶1）；巨噬细胞对照组；共8组。每组药物均为3个浓度。

1.3 实验方法 小鼠腹腔巨噬细胞的分离纯化和培养：用3%硫基乙醇酸盐（TG）0.5 mL注入小鼠腹腔内（每次实验8只），诱导腹腔巨噬细胞聚集，48 h后，断颈处死。用75%乙醇浸泡1～2 min，固定于解剖台上。用眼科剪刀在下腹部皮肤做V字切口，向上剥离皮肤，而后向腹腔内注入碱性磷酸盐缓冲液（PBS），5 mL，轻揉腹壁后，抽出腹腔液体放置离心管中。以1500 r/min速度离心10 min，弃上清液，加入DMEM培养液10mL重新悬浮细胞，再用1500r/min速度离心10 min，弃上清液。沉淀的细胞用含10%胎牛血清的DMEM营养液悬浮细胞，加入培养瓶中，置5%二氧化碳（CO2）、37℃培养箱中孵育2 h后，轻摇培养瓶弃除未贴壁的细胞。重新用10%胎牛血清的DMEM营养液悬浮贴壁细胞，台酚兰染色计数细胞成活率大于95%则可使用，调细胞浓度至 1×109个/L备用。

1.4 实验步骤 将浓度为1×109个/L的巨噬细胞悬液0.18 mL接种于96孔板各孔中培养，24 h后细胞处于增殖期，将各种药物0.02 mL分别加入96孔板各孔中，每组做6个平行孔。放入5%CO2孵育箱中培养，分别于24、72、120 h测定细胞活性。培养结束前 4 h 掺入 MTT（5 g/L）20 μL 继续培养，培养结束后弃上清液，加入1∶300盐酸-异丙醇溶液100 μL,置微量振荡器振荡10 min，用2010型全自动酶标仪于620 nm测定OD值。

1.5 统计学方法 采用Untitled-SPSS 13.0统计软件，所有实验数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较应用单因素方差分析做统计学处理，P<0.05表有显著性异。

2 结果

丹参粉针剂高浓度、中浓度、低浓度对腹腔巨噬细胞活性有促进作用；而随着时间的延长促进作用逐渐消失。复方丹参注射液只有高浓度对腹腔巨噬细胞活性有促进作用。白及中浓度在24 h对腹腔巨噬细胞活性有抑制作用P<0.01。见图1。

大黄水煎剂加白及水煎剂组高浓度、中浓度、对腹腔巨噬细胞活性有抑制作用；而中浓度随着时间的延长抑制作用逐渐消失。大黄水煎剂加丹参粉针剂组高浓度、中浓度、低浓度对腹腔巨噬细胞活性有促进作用。大黄水煎剂加复方丹参注射剂组仅高浓度、中浓度24 h时对其有促进作用。见图2。

各组间相比，大黄水煎剂加丹参粉针剂组对腹腔巨噬细胞活性的促进作用效果最好；大黄水煎剂加白及水煎剂组对腹腔巨噬细胞活性具有抑制作用。实验结果表明：大黄与不同的药物结成药对可以产生显著不同的效果。见表1。

表1 大黄与白及、丹参粉针剂、复方丹参配伍对小鼠腹腔巨噬细胞活性的影响(±s)Tab.1 Effect of rhubarb combined with Bletilla striata,salvia miltiorrhiza,compound salvia miltiorrbiza on the activity of peritoneal macrophage cell(±s)

表1 大黄与白及、丹参粉针剂、复方丹参配伍对小鼠腹腔巨噬细胞活性的影响(±s)Tab.1 Effect of rhubarb combined with Bletilla striata,salvia miltiorrhiza,compound salvia miltiorrbiza on the activity of peritoneal macrophage cell(±s)

注：与对照组比较（抑制），誗P<0.01；与对照组比较（抑制），#P<0.05；与对照组比较（促进），★P<0.01；与对照组比较（促进），*P<0.05。

组别高剂量组中剂量组低剂量组对照组n6666大黄与白及161.50±43.3誗218.83±84.29#335.66±39.89337.16±21.42大黄与丹参589.16±42.14★547.66±61.19★387.83±36.56*350.83±14.93大黄与复方丹参577.00±17.88★441.16±84.29★356.50±68.49350.83±14.93

3 讨论

中药配伍规律是中医药理论的精华之一，开展中药配伍研究对继承和发展中医药理论，具有重要的理论意义。方剂的配伍规律一直是古今医家苦苦探寻的焦点，也是近年来方剂研究的重点课题。活血与清下药物配伍治疗腹部疾病的临床和基础研究取得重大进展[4]。本实验选取其中的清下要药大黄、活血药物丹参、并选择止血药白及进行配对研究。探讨药对的协同增效作用。实验结果表明大黄与不同的药物结成药对可以产生显著不同的效果。此为中药配伍用药提供了实验数据。

大黄具有泻下攻积、泻火解毒、活血祛瘀、利胆退黄等功效，因其疗效卓著、历代沿用不衰。特别是许多医家精于配伍变化，拓宽了大黄的适应范围，积累了丰富的用药经验[2]。丹参具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦等功效，临床广泛用于活血化瘀、消炎和心脑血管疾患等症，是国内外现代化中药研究的热点品种之一。复方丹参注射液是由丹参和降香组成,降香功能为行气止痛，活血止血等功效。本实验结果显示大黄与丹参、复方丹参配伍能够协同增强小鼠腹腔巨噬细胞增殖活性，而大黄加丹参组有优于大黄加复方丹参组趋势。形成这种趋势的原因可能是中药降香在其中调控的结果。

中药白及具有收敛止血、清热利湿、消肿生肌之功效，是一种常用的中药。大黄与白及配伍显著抑制小鼠腹腔巨噬细胞增殖活性实验结果表明，具有止血功效的药味协同大黄增强抑制巨噬细胞增殖活性，同时验证了具有止血功效的中药降香下调巨噬细胞增殖活性的趋势。但是中药白及和降香两种药物，是否能协同大黄进一步调控巨噬细胞增殖活性，有待于深入研究。

[1] 邓文龙.试论中药复方配伍合理性研究与评价[J].中药药理与临床,2008，24（1）：73-76.

[2] 曹兰秀，顿宝生.试从中药配伍的特殊性谈中药复方药动学研究[J].陕西中医,2008，29（1）：96-98.

[3] 刘昌孝.中药药代动力学研究的难点和热点药学学报[J].2005，40（5）：395-401.

[4] 张志芳，郭 静，刘晋权.近十年来中药药对研究进展[J].内蒙古中医药,2007，26（1）：70-73.

[5] Fang Wang,Li-ting Cao，Song-hua Hu.A rapid and accurate 3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide colorimetric assay for quantification of bacteriocins with nisin as an example[J].Zhejiang Univ Sci B,2007,8(8):549-554.