花 血清免疫酶活力对水温耐受性的研究

方美娟，刘 凯，李智强

（1.浙江海洋学院萧山科技学院,浙江杭州 311258；2.杭州市农业科学研究院,浙江杭州 310024）

鱼类是水生变温脊椎动物，其生理代谢和生化反应在一定程度上受环境因素影响较大，水温是影响其生理代谢及其生化反应的重要影响因子。当水温发生变化时，血液组织中各种酶催化反映的条件就发生变化，导致酶活力发生改变。

花 Hemibarbus maculatus Bleeker属鲤形目、鲤科、鮈亚科、 属，俗称季郎鱼、溪竹等，是我国江河中重要的中小型经济鱼类。该鱼具有食性杂、分布广、群体产量高，体形优雅、肉质细嫩鲜美、市场俏销等特点。目前，对于探讨水温变化对花 生存及血清酶指标影响的研究，仍未见有报道。因此本文主要探讨了花 的生存温度和适宜温度及水温变化对其血清免疫酶活力的影响，以期为花 的苗种繁育与养殖提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用花 体重为100～200 g/尾，暂养在水族箱中，投喂颗粒饲料，每日清污、换水，pH为8.0～9.0。待稳定后随机抽取健康无损伤、活性较强的个体分组实验，实验过程中遮光控制光强。

1.2 温度耐受性实验

在水族箱中暂养，用控温电热棒和冰袋控温，设3个平行组，每组放入试验鱼10尾，将花 从自然水温 20 ℃开始每 6 h 升高或下降 4 ℃，直到设置水温止，实验水温梯度设置为 4、8、12、16、20、24、28、32、36℃。整个实验过程中，保持水体不断充气，养殖过程中不投饵。以花 身体不动但轻轻敲打后能游动称休克；长时间敲打身体不动则认为花 死亡。

1.3 水温胁迫对血清免疫酶活力影响的实验

1.3.1 血清的制备

从水中捞起花 ，迅速用滤纸吸干其体表水分后，直接从鱼的心脏采血，在室温下放置2～4 h，待血凝固收缩后，再放入4℃的冰箱中，静置过夜，使血块进一步收缩和析出血清。之后在5 000 r/min，4℃下离心5 min，收集上清液即为血清，-20℃保存备用。

1.3.2 酶活力测定

应用试剂盒测定方法进行测定，测定酶类为抗氧化酶（超氧化物歧化酶SOD和过氧化氢酶CAT），水解酶（酸性磷酸酶ACP和碱性磷酸酶AKP），所有试剂盒均购自南京建成生物工程有限公司。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2003和 SPSS 13.0 for Windows软件进行方差分析、多重比较及回归分析，数据以平均值±标准偏差表示，P＜0.05为差异显著。

2 结果

2.1 花 的温度耐受性

水温耐受性实验结果表明（表1），花 的生存水温较广，为4～32℃，适宜水温为8～24℃。

表1 花 对温度变化的耐受性Tab.1 The temperature tolerance of Hemibarbus maculatus Bleeker

2.2 水温胁迫对血清酶活力的影响

2.2.1 水温胁迫对抗氧化酶（SOD和CAT）活力的影响

实验结果表明（图1），在温度胁迫下，血清SOD活性随着温度的不断升高而发生显著变化。24℃以前，SOD活性随水温显著升高，在24℃时达到最高，且显著高于4℃、8℃、12℃各实验组，（P＜0.05）；24℃以后，虽然SOD活性无显著地缓慢增加，但有逐渐下降趋势；采用二次回归曲线拟合，其变化趋势如图2所示，呈现为抛物线规律，其拟合二元方程为SOD=36.802+12.345T-0.208T（2T表示温度，P＜0.001）。

图1 水温胁迫对血清抗氧化酶活力的影响Fig.1 The effect of temperature on the activity of antioxidant enzymes

花 血清CAT活性随水温升高呈现出上升的趋势，但CAT活性在个体之间存在较大的变异，最大个体CAT活性出现在36℃，最小个体CAT活性出现在4℃，但方差分析表明，水温对血清CAT活性无显著性差异（P＞0.05）。

图2 血清SOD活性与水温的二元拟合回归曲线Fig.2 Regression curve of serum SOD activity and temperature

2.2.2 水温胁迫对水解酶ACP、AKP活力的影响

实验结果表明（图3），在温度胁迫下，血清AKP活性随着温度的不断升高呈现出先升后降的变化，其中以4℃条件下花 血清AKP活性最低，与8℃组鱼血清AKP活性无显著性差异（P＞0.05），但与其他各组差异显著（P＞0.05）；而以24℃条件下花 血清AKP活性最高，与4℃、8℃、12℃、32 ℃各组鱼血清 AKP 活性差异显著性，（P＞0.05），但与其他各组无显著性差异，（P＞0.05）；采用二次回归曲线拟合，其变化趋势如图4，呈现为抛物线规律，其拟合二元方程为AKP=28.817+3.999 T-0.083 T（2P＜0.001）。

图3 水温胁迫对血清水解酶活力的影响Fig.3 The effect of temperature on the activity of the serum hydrolytic enzymes

花 血清ACP活性随水温升高呈现出明显的上升趋势，随着水温的升高，ACP活性显著上升，其中以4℃条件下花 血清ACP活性最低，与8℃组鱼血清ACP活性无显著性差异（P＞0.05），但与其他各组差异显著（P＞0.05）；而以36℃条件下花 血清ACP活性最高，与20℃、24℃、28℃、32℃各组鱼血清 AKP活性无显著性差异（P＞0.05），但与其他各组差异显著（P＞0.05）；根据回归统计ACP活性与水温间有显著的直线回归关系，其回归曲线图如图5所示，回归方程为 ACP=6.190+0.229 T（P＜0.001）。

图5 血清ACP活性与水温的一元拟合回归曲线Fig.5 Regression curve of serum ACP activity and temperature

图4 血清AKP活性与水温的二元拟合回归曲线Fig.4 Regression curve of serum AKP activity and temperature

3 讨论

有关研究发现，华鲮Sinilabeo rendahli幼鱼的生存温度为5～38℃，适宜温度为13～29 ℃[1]，嘉庚蛸 Octopus tankaheei的生存温度为 0.5～35 ℃，适宜温度为 12～31 ℃[2]，莫桑比克鳗鲡Anguillamor morata的生存温度为0～40℃，适宜温度为12～35℃[3]，齐口裂腹鱼幼鱼Schizothorax(schizothorax)prenanti的生存温度为 0.8～33.5 ℃，适宜温度为 5～27℃[4]，花 温度的生存温度为4～32℃，适宜温度为8～24℃，与其它水生动物相比，花 的生存温度和适宜温度也是比较广的，对温度的耐受性稍微低于莫桑比克鳗鲡[5]等。

超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）是机体抗氧化系统中最主要的两种抗氧化酶，在抗氧化过程中具有协同作用，当呼吸爆发产生大量的超氧阴离子（O2-）和H2O2等自由基后，O2-由SOD清除，CAT则起协同清除H2O2的作用[6]。实验结果表明（图1、2），水温胁迫对抗氧化酶活力的影响是显著的，在不同温度胁迫下，花 血清SOD活力的变化在24℃以前SOD活性增强尤为显著（P＜0.05）。SOD被认为是机体对抗自然水温暴露的保护剂[11]，随着水温升高，SOD活性不断增强，说明SOD在高温条件下对机体内由于温度升高而产生的氧化应激，消除过多的自由基从而维持机体代谢平衡。CAT活力在各温度组间未表现出显著差异，温度的变化对CAT活性影响不明显，推测可能由于温度升高所造成的氧化应激多数以O2-等自由基离子为主，而H2O2相对较少。

AKP和ACP是体内最重要的两种水解酶，广泛存在于动物血液和各种器官内，是评价动物生理代谢水平的一项重要指标[7，8]。花 是常年生活在水中的变温脊椎动物，水温的变化可显著影响其生理代谢水平。花 的适宜温度为8～24℃，当水温超过36℃时会造成一些个体的热死亡，实验设计中的几组高温实验组必然对花 造成了一种热应激，从而使其代谢水平下降，表现为水解酶AKP和ACP活性的降低。本实验表明，水温胁迫对花 水解酶活力的影响是显著的，高温和低温都会使水解酶活力显著降低，这可能是由于在水温胁迫下，细胞生理代谢效率降低，从而导致在细胞中的ACP和AKP酶活力下降。

温度是池塘养殖花 最重要的环境因子之一，它直接影响花 的代谢和免疫等生化指标，突然的环境变化包括台风和池塘通风条件等，都会导致水温的迅速变化。因此在花 养殖过程中应特别注意这些因素的影响，尽量保持养殖水温在适宜范围内。

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