日本囊对虾群体遗传多样性的线粒体序列分析

孟繁星，徐田军，王日昕

（浙江海洋学院海洋科学学院,海洋生物资源与分子工程实验室,浙江舟山 316004）

日本囊对虾Marsupenaeus japonicus属甲壳纲、十足目、游泳亚目、对虾科、囊对虾属，从红海、非洲东部到朝鲜、日本一带沿海都有分布，在我国东南沿海也有分布[1]。自20世纪90年代我国北方养殖的中国明对虾Fenneropenaeus chinensis发生白斑综合症病毒（WSSV）病后，日本囊对虾因肉质鲜嫩，营养丰富，耐低温、耐干能力强，逐渐成为我国的主要养殖品种[2]。日本囊对虾已成为黄渤海沿岸的重点养殖对象,并成功地开展了大规模的人工增殖放流，获得较高的回捕率[3，4]。许多研究表明遗传变异水平与生物的生长速度、抗病能力等生产性状密切相关[5]，随着日本囊对虾养殖面积的扩大和养殖苗种的推广，其遗传多样性和遗传结构必定会受到影响。因此，对我国现有的各养殖场的日本囊对虾进行科学的遗传评估，分析其遗传背景，从而选出优良的品种对促进我国淡水养虾业的可持续发展具有重要意义。

动物线粒体DNA（mtDNA）由于具有分子量小、结构简单、母性遗传、进化速度快等特征而被作为一种优良的分子标记广泛应用于动物的群体遗传学和系统进化研究中[6]。动物线粒体基因组中含细胞色素氧化酶（cytochrome c oxidase）三个亚基基因(COI,COII,COⅢ)、Cytb、ATPase6、ATPase8等 13个结构蛋白基因，它们都是线粒体内膜呼吸链的重要组分,是研究远缘物种分子系统演化和分类的有效基因[7]。本研究以浙江、福建、台湾的日本囊对虾为研究对象，对其线粒体COⅢ基因进行了分析，旨为进一步研究日本囊对虾分子系统学及其种群遗传学和自然种质资源保护提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用的日本囊对虾3个群体的样本分别采于我国东南沿海的浙江(ZJ)、福建（FJ）、台湾（TW）沿海，新鲜样品低温冷冻后长期保存。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组 DNA 的提取

采取常规苯酚氯仿提取法，并略有改进，每个样本取100 mg左右的尾部肌肉，剪碎后，加入500 μL组织匀浆缓冲液 (10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0;100 mmol/L EDTA，pH 8.0)，混匀后加入终浓度为 1%的SDS和100 μg/mL的蛋白酶K，55℃消化3 h,然后分别用等体积的 Tris饱和酚、Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提1次。无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤2次，TE溶解。 紫外分光光度计测定样品DNA溶液的浓度和纯度，4℃保存备用。

1.2.2 PCR 扩增和产物鉴定

用于PCR扩增的引物分别为4750F:GACACCACGCCTTCCACCTA和5523R:GCAGCAGCTTCAAATCCAAA，引物由上海生工生物技术有限公司合成。反应在Bio-Rad Mycycler型PCR仪上进行。反应体系为 50 μl，其中含 10×Buffer 5 μL，dNTP 各 0.2 mmol/L ，上、下游引物各 0.2 μmol/L,模板 DNA 50～100 ng，Taq plus DNA聚合酶2 U(Tiangen)，MgCl21.5 mmol/L。反应条件如下：94℃预变性3 min；94℃变性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。每次反应都设不含模板的空白对照。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳缓冲液为0.5×TBE(pH 8.0)，电压为5 V/cm，常温电泳，EB染色，用Bio-Rad GD2000型凝胶成像系统拍照记录。

1.2.3 DNA 序列测定

将PCR产物送往上海生工生物技术有限公司，纯化后直接进行测序反应，测序引物为4750F:GACACCACGCCTTCCACCTA。

1.2.4 序列分析

获得的序列经人工校正后在NCBI中进行同源序列BLAST，确认其为日本囊对虾COⅢ基因的部分DNA序列，并从GenBank数据库中下载了加州美对虾（Farfantepenaeus californiensis，EU497054）、斑节对虾（Penaeus monodon，AF217843）、凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei，NC_009626）、细角滨对虾（Litopenaeus stylirostris，EU517503）、中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis，DQ518969）等 5 种对虾的 COⅢ 基因的DNA序列用于系统发生关系的分析。利用MEGA4.0软件分析DNA序列，计算碱基组成比例和遗传距离并构建系统进化树；利用DnaSP4.0软件进行多态性指标。

2 结果

2.1 日本囊对虾COⅢ序列特征及突变分析

对所有测得的日本囊对虾3群体的COⅢ序列进行比对后，共得到了577 bp用于进行分析的基因序列，与GenBank数据库中的序列对比后发现与对虾科的其他虾类具有很高的相似性，适合进行分析。碱基组成见表1，T、C、A、G四种碱基的含量分别为27.2%、16.5%、33.8%、22.6%，在所有试验个体中没有明显差异，A+T平均含量为61%，明显高于G+C的39%。在所测序列中共有51个变异位点，占位点总数的8.8%，共有简约信息位点18个，占位点总数的3.1%，无插入或缺失位点，转换与颠换比值为4.6；台湾群体中包含变异位点11个，简约信息位点7个，浙江群体中包含变异位点25个，简约信息位点5个，福建群体中包含变异位点29个，简约信息位点3个。这3个群体的平均核苷酸变异数为4.537。

表1 5种对虾mt DNA COⅢ基因部分序列的碱基组成Tab.1 Base composition in partial mtDNA COⅢgene sequences of five species of penaeidae

从51个COⅢ碱基序列变异位点中，共定义了31个单倍型，用H1～H31表示，单倍型及其位点见表2。台湾、福建、浙江群体中分别有9、13、11个单倍型。日本囊对虾3个群体的遗传多样性参数见表3，福建群体的单倍型多样性和核苷酸多样性均最高，分别为0.989和0.009 2；而台湾群体则最低，分别为0.964和0.005 8，浙江群体居中，分别为0.989和0.007 8。

表2 日本囊对虾COⅢ序列核苷酸多态位点及其各单倍型Tab.2 Nucleotide polymorphic sites and haplotypes in COⅢgene sequences of M.japonicus

表3 日本囊对虾3个群体的遗传多样性参数Tab.3 Parameters summary of genetic diversity of M.japonicus from the three stocks

2.2 日本囊对虾的遗传多样性分析

基于所测得的3种日本囊对虾和对虾科中另外5种对虾的COⅢ同源序列，采用Neighbor-Joining法[8]构建系统发生树，用Kimura双参数法（Kimura 2-parameter）计算遗传距离，用MEGA4.0软件[9]进行系统发生的分析。发现日本囊对虾的三个群体先聚成一小枝，再与中国明对虾聚成一大枝；凡纳滨对虾和细角滨对虾聚成一小枝，再分别于加州美对虾和斑节对虾聚成另一大枝。

图1 NJ法构建的6种对虾的分子系统树Fig.1 Molecular phylogenetic tree of six species of penaeidae shrimp

3 讨论

ZARDOYA等[10]分析了脊椎动物mtDNA基因上13个蛋白编码基因包含的系统发育信息，不考虑数据处理和加权的方法，将13个基因分为好、中、差3组。好的一组基因含有良好的系统发育信息，它们是：ND4、ND5、ND2、Cytb 和 CO I；中等的一组基因含有一定的系统发育信息，它们是：COII、COⅢ 、ND1 和ND6；差的一组基因不能很好地提供系统发育信息，它们是：ATPase6、ND3、ATPase8和ND4L。而日本学者MIYA等[11]对已知分类关系的8种硬骨鱼类的线粒体不同蛋白质编码基因所含有的系统发育信息进行了研究后表明，13个蛋白编码基因含有的系统发育信息明显不同，大致分为非常好、好、中等、差和非常差5个类别。 非常好的一组包括ND5、ND4、COⅢ 和COI，好的一组包括COII和Cytb，中等的一组包括ND3和 ND2，差的一组包括ND1和ATPase 6，非常差的一组包括ND4L、ND6和 ATPase 8。这与ZARDOYA的观点有所差异，MIYA认为观察的普遍性还不能确认，需要进一步研究。一些研究学者认为，对属内不同种、种内不同亚种或不同地理型之间的物种鉴定，COⅢ基因不失为一种较为有效的分子标记[12-14]。

本研究测得了日本囊对虾COⅢ基因的部分碱基序列，其中AT含量为61%，明显高于GC含量，这和在其他甲壳类中观察到的mtDNA的碱基分布情况相似[15-18]。序列的碱基组成也符合AT含量高，碱基G的相对缺乏是动物mtDNA碱基组成的特点。在线粒体中，变异位点的转换较易在近亲种间频繁地发生，而颠换在较远缘种间逐渐明显；在同一物种中，转换往往在数量上远超过颠换[19]。本研究中日本囊对虾mtDNA COⅢ碱基序列转换与颠换比为4.6，这与核苷酸的替换主要以转换为主，转换多于颠换，表现较高的转换偏向[20]的规律相符。这也说明本文所研究的3个日本囊对虾群体线粒体的变异仍然是种内变异。

用NJ法构建的系统树显示日本囊对虾的3个群体先聚成一小枝，再与中国明对虾聚成一大枝；凡纳滨对虾和细角滨对虾聚成一小枝，再分别于加州美对虾和斑节对虾聚成另一大枝。目前对于对虾科种类的mtDNA COⅢ基因的研究较少，本次实验得到了日本囊对虾mtDNA COⅢ基因序列，虽然发现这3个群体间存在一定的差异，但是由于变异位点较少，不足以准确地区分日本囊对虾这3个群体的遗传特性。本研究接下来会对线粒体其他变异较大的基因(如COI、Cytb、D-loop)进一步分析，以得到更多的信息，从而更全面、更客观地了解日本囊对虾的遗传背景。

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