农杆菌介导SAD基因转化浅白隐球酵母的条件优化

陈东亮，李纪元，范正琪，范妙华，田 敏

（中国林业科学研究院亚热带林业研究所，浙江 富阳 311400）

生物质能源的开发利用是解决能源危机的重要途径之一。植物油脂是生产生物柴油的主要原料来源，具有一定的规模，但高昂的原料成本[1]严重限制了该产业发展。利用微生物油脂为原料生产生物柴油的途径不存在此问题，且具有资源丰富、油脂含量高、碳源利用广等特点，可以实现大规模工业化生产。

最适合做生物柴油的脂肪酸是：有较长的直碳链，最好有一个不饱和双键存在脂肪酸[2]。植物中的Acyl-ACP脱饱和酶定位于质体上，催化植物不饱和脂肪酸生物合成途径中的第一步脱饱和反应，直接调控着饱和与不饱和脂肪酸的比例。△9硬脂酰-ACP脱饱和酶（Stearoyl-ACP desaturase），简称：SAD，是目前研究最多、最广泛的Acyl-ACP脱饱和酶。该酶催化硬脂酸在第9～10碳原子之间脱氢形成第一个双键，生成油酸。为提高优良产油菌浅白隐球酵母（油脂含量可达细胞干重的65%）脂肪酸的质量，笔者利用基因工程技术将木本油料树种千年桐（Vernicia Montana）中的SAD基因转入到浅白隐球酵母，期望通过调节其代谢途径提高其油脂质量。

与PEG-CaCl2法、醋酸锂法、电击法、基因枪法等传统真菌遗传转化方法相比，根癌农杆菌介导法（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）具有操作简便、遗传稳定、转化率高、重复性好等优点[3-4]，因此它成为了当前发展最快、应用最广的遗传转化方法之一。笔者利用ATMT法对浅白隐球酵母进行遗传转化，并对影响转化结果的若干关键因素进行了研究探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 SAD基因（全长1 191 bp）的真菌表达载体pCAM 2300-sad由本实验室构建[5]，该质粒携带CAMV 35S强启动子和新霉素磷酸转移酶基因（NPT II）；根癌农杆菌 LBA 4404、AGL-1（均含质粒pCAM 2300-sad）为本所实验室保存；高产油脂的浅白隐球酵母（Cryptococcus albidus）购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。

1.1.2 试 剂 卡那霉素、利福平、头孢呋辛钠和乙酰丁香酮（Acetosyringone，AS）购自上海生工公司，PCR试剂购自TAKARA公司，其他化学试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基 LB培养基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，氯化钠 10 g/L，调 pH 至 7.0；YPD 培养基：蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，自然pH；SM培养基（选择培养基）：酵母氮基6.7 g/L，葡萄糖20 g/L，调pH至6.0；MM（基本培养基）、IM（诱导培养基）的配制参考文献[6]。

1.2 方法

1.2.1 农杆菌Ti质粒转化浅白隐球酵母 将含有质粒pCAM 2300-sad的根癌农杆菌在LB平板培养基（含 50 μg/mL卡那霉素，50 μg/mL利福平）上划线活化，挑取农杆菌单克隆接种于10 mL液体LB培养基中（含50 μg/mL卡那霉素，50 μg/mL利福平），28℃，180 r/min 振荡培养 18 h，离心收集菌体。用IM培养基重悬（含50 μg/mL卡那霉素，50 μg/mL利福平），稀释至OD600至0.15左右，继续培养5～6 h至OD600为0.4～0.6；接种浅白隐球酵母于10 mL YPD培养基中，28℃，180 r/min振荡培养18 h后，按1∶5稀释到YPD新鲜培养基中，培养5～6 h。分别离心收集酵母和根癌农杆菌菌体，用无菌水清洗一次，用IM培养基重悬菌体，农杆菌浓度稀释至OD600为0.5左右（细胞浓度约1010个/mL），酵母稀释至OD660为0.7左右（细胞浓度约108个/mL）。各取50 μL加入10 mL IM培养基（含 AS 200 μmol/L）中，25℃，180 r/min 培养过夜后，取 100 μL培养液涂布铺有微孔滤膜的IM（含AS 200 μmol/L）平板上，25℃倒置遮光培养2 d。

1.2.2 转化子的筛选 将微孔滤膜转接到含100 μg/mL卡那霉素，200 μg/mL头孢呋辛那的SM培养基（SMⅠ）上，培养3～5 d后，将初筛得到的转化子和野生型浅白隐球酵母同时在含150 μg/mL卡那霉素，300 μg/mL头孢呋辛那的SM培养基（SMⅡ）平板上划线，倒置培养3～5 d，观察其生长情况，仍能够正常生长的可以初步认定为是阳性转化子。

1.2.3 转化子基因组DNA的提取及PCR鉴定采用玻璃珠法提取阳性转化子基因组DNA。根据千年桐SAD基因序列设计特异引物：上游引物：5'-ATCAATCCTTTCATTTCCCAGTCTC-3'；下游引物：5'-TTATCCACCTACCATCTGCCCAC-3'。PCR 反应条件为：94℃预变性 4 min，94℃变性 30 s，57℃退火30 s，72℃延伸 1 min，30个循环后，72 ℃延伸 10 min。PCR扩增产物采用0.8%（W/V）的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 各影响因子的试验设计 转化的基本条件为农杆菌LBA 4404预培养后，调至OD600为0.5左右（细胞浓度约1010/mL），酵母稀释至OD660为0.7左右（约 108个/mL），各取 50 μL加入 10 mL IM 培养基（含AS 200 μmol/L）中。25℃，180 r/min培养过夜后，取100 μL培养液涂布铺有微孔滤膜的IM（含AS 200 μmol/L）平板上，25℃倒置遮光共培养 48 h。对某一因子进行研究时其他因子保持不变，单因子设置为：选用LBA 4404和AGL-1两种农杆菌菌株；酵母浓度分别为 1×106、2.5×106、5×106、1×107、1.5×107、2×107个 /mL；农杆菌浓度分别为 2.5×108、5×108、1×109、2×109、3×109个/mL；共培养时间分别为12、24、36、48、60 h；共培养期 AS 浓度分别为 0、200、400、600、800 μmol/L。每个因子重复 3 次，观察转化子生长情况，统计转化子数量。

2 结果与分析

2.1 转化子的筛选及PCR鉴定

在SMⅠ培养基上筛选3 d左右后，能清晰观察到转化子菌落（如图1-A），将转化菌落与野生型浅白隐球酵母涂布在高筛选压的SMⅡ培养基上，28℃倒置培养3～5 d，生长状态如图1-B。野生型酵母的对照不能生长，而大多数转化子仍能正常生长。据此，初步认仍能正常生长的为阳性转化子。

图1 浅白隐球酵母转化子在SM培养基上的生长

将初步判定的阳性转化子接种于新鲜的YPD培养基中，28℃，180 r/min振荡培养36 h，提取基因组DNA进行PCR检测，同时用野生型浅白隐球酵母做对照。琼脂糖凝胶电泳结果见图2。可以看出，大部分转化子在与阳性对照相应的部位扩增出了特异条带，而阴性对照没有此条带，这初步表明SAD基因已成功导入转化子。

图2 转化子SAD基因的PCR鉴定

2.2 农杆菌菌株对遗传转化的影响

在其他条件一致的情况下，实验选取了LBA 4404和AGL-1两种不同类型的农杆菌进行介导转化，其中LBA 4404属章鱼碱型，AGL-1为典型的农杆碱型菌株。每个菌种介导的转化重复3次，结果显示两种农杆菌菌株介导转化都能获得阳性转化子，但菌株AGL-1介导的效率明显高于菌株LBA4404，约为其2倍，说明AGL-1更适合介导浅白隐球酵母的转化。

2.3 农杆菌浓度对遗传转化的影响

当共培养时酵母的浓度保持5×107个/mL不变时，农杆菌LBA4404起始浓度依次为2.5×108、5×108、1×109、2×109、3×109个/mL，其他条件保持一致。由图3可知，农杆菌浓度对转化的影响极大，起初随着农杆菌浓度的增加，转化子数目也随之增加，但当农杆菌的浓度大于1×109个/mL时则会由于农杆菌的严重污染而导致转化子数量减少。因此，实验中农杆菌的最佳浓度为1×109个/mL。

图3 农杆菌浓度对转化的影响

2.4 酵母浓度对遗化转化的影响

酵母是转化的受体，其浓度也直接影响着转化子数目。从图4可以看出，随着酵母浓度的增加，转化子数目开始是增加的。但当酵母浓度超过1×107个/mL时，众多菌落拥挤在一起给转化子的辨认和分离造成了麻烦，同时假阳性转化子比例增加，而酵母浓度在2×107个/mL时，假阳性比例高达80%以上。实验中酵母起始浓度控制在5×106至1×107个/mL之间效果最佳。

图4 酵母浓度对转化的影响

2.5 共培养时间对遗传转化的影响

共培养12 h，转化子为0，无农杆菌污染；共培养24 h，转化子1个，无农杆菌污染；共培养36 h，转化子14个，存在农杆菌污染；共培养48 h，转化子23个，农杆菌污染加重；共培养60 h，已无法分辨转化子，农杆菌污染严重。由此可见，共培养时间若低于24 h，则很难获得转化子，随着共培养时间的延长，获得的转化子数目也增多，在培养时间为48 h时达到最高。但培养时间的延长也会导致农杆菌污染的加重以及筛选时农杆菌难以抑制。当共培养时间大于60 h时，严重的农杆菌污染导致转化子无法正常生长。

2.6 共培养期AS浓度

AS在培养中起着诱导农杆菌毒性基因表达，启动侵染反应的功能。在共培养阶段，不同浓度（0、200、400、600、800 μmol/L） 的 AS 对转化的影响结果如图5所示。在共培养阶段缺少AS的诱导时，仅能获得极少量的转化子，但添加200 μmol/LAS后转化效率得到显著提高。若继续提高AS浓度，转化效率也不会有明显改善，表明AS浓度为200 μmol/L时毒性基因已被充分激活。

3 小结与讨论

图5 AS浓度对转化的影响

实验采用根癌农杆菌介导法，实现了千年桐SAD对浅白隐球酵母的遗传转化，获得了阳性转化子，并通过PCR检测出证明SAD基因已经成功转化到酵母中，初步建立并优化了根癌农杆菌介导浅白隐球酵母的遗传转化体系。

不同的农杆菌菌种具有不同的毒性，转化得到的效率也不同，研究表明，农杆菌AGL-1菌株在许多研究中表现出较高的效率[7]。实验选用了章鱼碱型农杆菌菌株LBA 4404和农杆碱型菌株AG1-1为宿主，结果与上述研究一致：AGL-1介导的效率明显高于LBA 4404，这可能与菌株AGL-1高活性的Vir基因有关。农杆菌毒性基因的表达需要AS的诱导，AS的应用阶段主要有预培养和共培养两个时期，而共培养时期的作用更为重要，大多数研究者认为共培养期不加AS是不能获得转化子的。本实验在共培养期缺失AS的条件下也获得了少量的转化子，但添加AS使得转化子的数目大大的提高了，这同 Weiguo Fang等转化绿僵霉（Metarhizium anisopliae）的结果相似。另外，实验中AS浓度变化对转化影响不大，说明AS浓度为200 μmol/L时，已能充分激活农杆菌毒性基因的表达。

农杆菌和酵母浓度对转化都有显著的影响，农杆菌和受体菌浓度太低都不能得到理想的转化效率[8]。当农杆菌达到一定浓度后效率达到最高，此时农杆菌浓度继续增加也不能增加转化子数量，这主要是由于受体细胞外可用于农杆菌结合的位点数量有限，因此有研究者对农杆菌和受体细胞数量比进行研究，认为这样更能说明问题。而农杆菌浓度过大时，后期的过度生长会与受体竞争养份和空间[9]而影响转化子的正常生长，并给转化子筛选时农杆菌的去除带来麻烦；酵母的浓度太大，则会导致转化子不易分辨和假阳性的增加。通常筛选时可以通过增加抗生素和抑菌素浓度的方式抑制农杆菌和假阳性转化子的生长，但有时也会抑制，阳性转化子的生长。在本实验中，共培养时农杆菌浓度为1×109个/mL，酵母为 5×106～1×107个/mL 时可以得到理想的转化效率并保持较低的假阳性率和农杆菌的污染。农杆菌的附着、T-DNA的切割、转移以及整合到受体染色体DNA等过程的完成需要一定的时间，这个时间的长短受受体自身特性及转化条件的影响而不同，低于这个临界点则不能获得转化子。本实验中共培养时间短于24 h不能得到转化子，随着时间的延长转化子数目也增加，但超过60 h则会由于严重的农杆菌污染。除了以上因子，共培养温度[10]，培养基 pH[11]，载体结构[12]，载体膜等也能影响转化效果，这些都有待于进一步的研究。

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