卵黄卵磷脂提取纯化及纯度鉴定实验设计

臧荣鑫蔡勇

(1西北民族大学生命科学与工程学院 甘肃兰州730030;2西北民族大学实验中心 甘肃兰州730030)

卵黄卵磷脂提取纯化及纯度鉴定实验设计

臧荣鑫1蔡勇2

(1西北民族大学生命科学与工程学院 甘肃兰州730030;2西北民族大学实验中心 甘肃兰州730030)

采用正交设计分离提取卵黄中的卵磷脂，进一步使用硅胶柱层析纯化手段，获得卵磷脂纯品，并对其进行薄板层析和紫外分光光度法的纯度鉴定，以此作为生物工程、生物技术专业综合性生物化学设计实验的教学内容。

本文将“卵黄卵磷脂提取纯化及纯度鉴定”作为生物工程、生物技术专业的一个生物化学综合性设计实验，主要内容包括:①正交设计法分离提取卵黄卵磷脂;②用硅胶柱层析法纯化卵磷脂;③分别采用薄板层析法、紫外分光光度法进行纯度鉴定;④ 对提取工艺进行综合评价。实验中综合了萃取技术、分离技术、柱层析技术、薄层层析技术、紫外分光光度法等内容。目的在于通过本实验使学生掌握生物活性分子分离提取的策略及一般方法，并对使用的技术路线或提取工艺进行合理性的评价。

1 实验原理

卵黄中的甘油三酯占全部脂类的60%，磷脂约占28%，甾醇脂及其他约占6%。磷脂易溶于乙醚、苯、氯仿，部分溶于乙醇，极难溶于丙酮;卵磷脂溶于乙醇、甲醇、氯仿等有机溶剂，但不溶于丙酮;丙酮能够溶解油脂和游离脂肪酸、甘油三酯等［1］。因此，本实验在用化学试剂从蛋黄中提取卵磷脂时，以乙醇、乙醚为溶剂，丙酮为沉淀剂，经过抽滤、干燥等步骤，最终获得卵磷脂。新提取得到的卵磷脂为白色蜡状物，与空气接触后，会因所含不饱和脂肪酸被氧化而呈黄褐色。

2 实验方法

2.1 正交设计法粗提卵黄卵磷脂

取10g蛋黄放入洁净的具塞三角瓶中，加入适量有机溶剂搅拌15min，然后静置15min，过滤;滤渣进行二次提取，合并二次滤液，低温减压浓缩至少量，加入一定量丙酮去除杂质，卵磷脂即沉淀出来;过滤，滤饼用丙酮反复冲洗数次，待残余丙酮挥发掉，即得到卵磷脂粗品;称其质量。

生物活性物质的提取受多种因素的影响，如温度、时间、溶剂比、料液比等。这种受多因素影响的实验可以通过正交法进行;通过较少的实验次数即可取得较好的效果。本实验运用正交法研究提取温度、提取时间、醇醚比、料液比这4个因素对提取卵黄卵磷脂的影响，从而获得卵磷脂的较佳提取条件。

(1)实验设计:本实验取4个因素，即提取温度、提取时间、醇醚比、料液比，每个因素选3个水平，具体见表1。

表1 提取温度、提取时间、醇醚比例、料液比3个水平的分组情况

按一般方法，如对4个因素3个水平的各种组合都要考虑，共需做34=81次试验，而用L9正交表安排只需做9次试验。实验安排详见表2。

表2 根据正交表L9设计的实验安排表

(2)数据统计及分析:实验完成后，将9个数据填入表2试验结果栏，分别计算出3个水平试验结果总和，再分别取平均值(各自被3除)，最后计算极差(这一列中最好与最坏之差)。从极差的大小可以看出哪个因素对提取卵磷脂影响最大，哪个影响最小，从而找出最佳提取条件。

2.2 卵磷脂的纯化

取活化后的柱层析硅胶加适量无水乙醇搅拌成糊状，装柱，用洗脱液(V(乙醇):V(甲醇) =1:1)平衡后，加入10mL 0.224g/mL的卵磷脂粗品，二次平衡后洗脱，洗脱时流速控制为2.5mL/min。根据色谱工作站的曲线和定性检测结果，确定目标试管，收集洗脱液，浓缩、干燥，得到纯化卵磷脂［2-3］。

2.3 薄层层析法鉴定

将硅胶G与0.25%的羧甲基纤维素钠水溶液按1:3比例调成糊状，然后涂布于9cm× 20cm的玻璃板上，厚度0.2cm，自然阴干。使用前置于120℃烘箱中活化1～2h。用微量取样器取10uL样品液，点样，待自然干燥后置于层析缸中，展开剂为氯仿-甲醇-水(80:25:3)［4］。待展开剂距顶部2cm时，层析完成，取出硅胶板，吹干，用碘水喷洒显色。结果见图1。图1表明卵磷脂粗品经硅胶G柱层析后得以纯化，且纯化效果明显。

2.4 紫外可见吸收光谱鉴定

分别取卵磷脂标准品乙醇溶液和样品的乙醇溶液，在200～600nm范围内进行紫外可见光谱扫描，对吸收光谱进行比较，鉴定样品，确定最大吸收峰。实验结果表明:①标准品吸收光谱(图2)与各洗脱条件下获得的卵磷脂样品的吸收光谱相比，波型基本相同;②标准品吸收光谱与粗提卵磷脂样品相比有较大差别，但213nm处同样存在特征吸收;③卵磷脂在200～310nm处有特征吸收，在213nm处为最大吸收峰，此特征可作为紫外分光光度法鉴定卵磷脂的依据。

3 结论

3.1 粗提条件

图1 卵磷脂薄层层析图

图2 卵磷脂紫外吸收光谱

从蛋黄中提取卵磷脂，以卵磷脂的收率为主要控制指标，以乙醇和乙醚作为溶剂，丙酮作为沉淀剂粗提卵磷脂，研究探讨了提取温度、提取时间、醇醚比、料液比等因素对提取效果的影响。结果表明，最佳条件为:提取温度25℃;提取时间60min;醇醚比4:1;料液比1:5。

3.2 纯化条件

通过单因素试验确定柱层析法纯化卵磷脂最佳洗脱条件为:先用无水乙醇洗脱，待第一组分被洗脱完成后，改用V(乙醇):V(甲醇)=1:1的洗脱液进行梯度洗脱。

3.3 实验设计评价

薄层层析法及紫外可见吸收光谱鉴定表明:实验所得样品纯度高，紫外吸收特征与文献报道的结果一致;该实验设计科学合理，方法切实可行，能满足综合性设计实验的教学要求。

［1］ 宋宏新.陕西科技大学学报，2003，21(4):6

［2］ 赵彬侠，许晓慧，张小里，等.西北大学学报(自然科学版)，2003，33(2):171

［3］ 张志强，王云山，苏志国.高校化学工程学报，2001，15(1):56

［4］ 李卫.湖北工学院学报，2000，15(1):41