多肽T140类似物的18F标记

韩彦江 程登峰 张 岚 郑明强 周 伟尹端沚 武明星 马玉飞 汪勇先

1（中国科学院上海应用物理研究所放药中心 上海 201800）

2（中国科学院研究生院 北京 100049）

癌症的发病率一直呈高增长势头，其近端和远端发生转移是癌症分期的重要标志，也代表着治疗后痊愈、恢复及生存机会的高低。研究表明，趋化因子(Chemokines)及其受体(Chemokine Receptors)与癌症的发病及转移有密切关系。趋化因子是不同类型细胞分泌的低分子量(8–10 kd)的细胞因子，它们对各种白细胞亚类，如中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞具有趋化和预激活作用[1]。趋化因子受体是一类表达于不同类型细胞上的含有7个跨膜区的G蛋白偶联受体。趋化因子通过作用于趋化因子受体参与多种生理和病理过程，如细胞的生长、发育、分化、凋亡等，通过趋化吸引白细胞、调节其效应功能等参与免疫应答过程[2]。

基质衍生因子(SDF-1，又名CXCL12)是主要由骨髓基质细胞合成释放的趋化因子，属CXC亚族，其受体为CXCR4。SDF-1在人的T淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞中有表达，在人的胰脏、小肠、卵巢、脾脏等器官更有高度表达。CXCR4受体分布在B淋巴细胞、树突状细胞、内皮细胞及成熟巨核细胞上。SDF-1与CXCR4相互结合发挥作用，是SDF-1发挥生物学功能的基础。SDF-1与 CXCR4对生物学轴不仅参与胚胎、血管、神经、心脏形成，还参与T、B等免疫细胞和造血干细胞发生及迁移等正常生理活动[3–7]。近年研究表明，SDF-1和CXCR4与慢性炎症、HIV-1的病毒转录、多种肿瘤的特异性转移有着密切关系[8–14]。目前，肺癌、卵巢癌、乳腺癌、白血病等众多肿瘤细胞中均发现有CXCR4的高表达，并且CXCR4已成为肿瘤诊断与治疗的新靶点，越来越受到人们的重视。

CXCR4受体的抑制剂包括小分子、多肽类抑制剂，具有治疗艾滋病和其他相关疾病的潜力。化学小分子AMD3100已被美国FDA批准为动员干细胞迁移的临床药物[15]。多肽类抑制剂包括ALX-40-4C[16]、 CTCE-9908[17]、FC131[18]、POL3026[19]和 T140[20]。T140是一类对 CXCR4受体与其单抗的结合具有很强抑制作用的十四肽，其第二位的精氨酸(Arg2)、第3位的L-3(2-萘基)丙氨酸(NaI3)、第五位的酪氨酸(Tyr5)和第十四位的精氨酸(Arg14)组成了其药效活性区域[21]。本研究的目的是发展一种CXCR4的受体显像剂。为提高多肽的体内稳定性，将多肽的C端氨基化，N端乙酰化，因标记需要，保留了第八位的赖氨酸，将第七位的赖氨酸换成了精氨酸，这样形成了多肽 T140的类似物AcTZ14011，其结构如图1所示。

已报道的CXCR4受体的显像剂有99mTc标记的SDF-1[22]、Cu64标记的小分子amd3100[23]和111In 标记的多肽AcTZ14011[24]。目前，我国提供临床使用的正电子核素是11C和18F，其中18F核素性质优良：半衰期较长(T1/2=109.8 min)，正电子能量较低(0.64 MeV)而对正常组织的辐射损伤较小，氟的范德华半径(0.135 nm)与氢(0.12 nm)相似而不影响标记化合物的生物活性。我国的新建医用回旋加速器增多、18F的来源范围更为广泛，为18F标记化合物的研发提供了便利。N-琥珀酰亚胺-4-[18F]氟苯甲酸酯([18F]SFB)是18F标记多肽和蛋白质中最常用的中间体，只要目标分子中有赖氨酸的ε氨基，就可进行标记，其合成方法简便，放化产率高。本研究旨在探讨18F通过[18F]SFB标记多肽AcTZ14011及其条件的优化。

图1 多肽AcTZ14011的结构简图Fig.1 Structure of peptide AcTZ14011 Nal: l-3-(2-naphthyl)alanine, Cit: l-citrulline.

1 实验材料和仪器

1.1 试剂与材料

前体乙基-4-三甲胺苯甲酸酯-三氟磺酸盐和对照品 N-琥珀酰亚胺-4-氟苯甲酸酯(SFB)按照文献[25]直接合成。多肽AcTZ14011购自苏州中科天马肽工程中心有限公司，纯度大于 90%。K222(Kryptofix 222)、无水乙腈和无水碳酸钾，美国Sigma-aldrich公司产品；乙腈，HPLC级光谱纯，美国TEDIA公司产品；4-氟苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N,N’-二环己基碳酰亚胺(DCC)、乙基一二甲胺苯甲酸醋、CH3SO3CF3、O-(N-琥珀酰亚胺)N,N,N’,N’一四甲基脲四氟硼酸盐(TSTU)，购自瑞士 Fluka公司；四氢呋喃、氢氧化四丙基胺 (1 mol/L的水溶液)购自德国 Aldrich公司；富[18O]氧水，以色列Rotem公司产品。氢氧化钠、浓盐酸、碳酸氢钠、乙醇、无水乙醚、乙酸乙酯和三氯甲烷等均为国产分析纯或光谱纯，购自国药集团上海化学试剂公司。除注明外，化学药品均未经进一步纯化，直接使用。

Sep-Pak QMA柱、C18柱，美国Waters公司产品；GF254薄层层析硅胶板(2.5 cm×10.0 cm，玻璃基片)，烟台汇友硅胶开发有限公司产品；Millex®GS 0.22 µm微孔过滤器，美国Milipore公司产品。

1.2 仪器

医用回旋加速器(Eclipse ST，40 µA，11 MeV)；Brucker AM-300(300M)核磁共振仪；FJ-391A2型微机放射性活度计(北京核仪器厂)；高效液相系美国Dionex公司，配有P680泵、PDA-100 光电二极管阵列探测器以及 Bioscan Flow-Count 探测器(美国Bioscan公司)；Radio-TLC薄层扫描仪(Bioscan AR-2000，美国Bioscan公司)；WRS-1A数字熔点仪；RE52-2旋转蒸发器(上海沪西分析仪器厂)。

2 实验方法

2.1 [18F]离子的产生

无载体的18F离子由18O(p,n)18F反应产生。加速器轰击后，在N2压力下，含18F离子的富氧水通过经预处理的QMA柱，18F离子吸附于柱上，富氧水则收集于回收瓶中。

2.2 [18F]SFB的放化合成

用 1.5 mL K2CO3溶液(0.02 mmol/L，含 K22217.72 mg)将18F洗脱进一个5 mL的Mini- vial(美国Alltech公司)中，与0.4 mL乙腈在100℃共沸蒸干两次。向盛有干18F的反应瓶中加入4-三甲胺苯甲酸乙酯三氟磺酸盐(5 mg，16 µmol，溶于0.3 mL无水乙腈)，100℃加热10 min。反应液冷却后，加入1 mol/L的NaOH 0.7 mL，110℃反应5 min，冷却后加入1 mol/L的HC1 0.9 mL，反应液通过一活化的Sep-Pak C18柱，先用2 mL的0.01 mol/L盐酸淋洗，用N2吹干Sep-Pak C18柱，再用3 mL乙睛洗脱得到4-[18F]氟苯甲酸。将20 µL氢氧化四丙基胺的水溶液加入其中，100℃共沸干燥，加入 12 mg TSTU(溶于0.25 mL乙腈中)，90℃反应5 min。然后用3 mL的5%醋酸酸化，再用6 mL水稀释。将上述溶液通过一活化的Sep-Pak C18柱，依次用10 mL乙睛/水(V:V=1/3)淋洗，用N2吹干Sep-Pak C18柱，用2 mL二氯甲烷洗脱。TLC、HPLC测放射化学纯度和测活度，计算放化产率。

2.3 [18F]SFB与多肽的偶联

将用来溶解[18F]SFB的二氯甲烷吹干，加入50µL乙腈溶解，加入100 µg多肽AcTZ14011 (溶于150 µL pH 8.5的0.1 mmol/L硼砂－硼酸缓冲液)，42℃反应30 min。反应液通过HPLC分离。HPLC系统采用如下梯度制备法(其中A为含0.1%三氟乙酸的水溶液，B为含 0.1%三氟乙酸的乙腈溶液)：0–25 min内95%–10%溶剂A，25–30 min内10%A，30–35 min内 10%–95%A，流速 2.5 mL/min。

2.4 标记多肽的质量控制

将HPLC流出液用旋转蒸发仪蒸干，再用医用0.9% NaCl注射液溶液，NaHCO3调节pH至7.0左右，过0.22 µm滤膜，所得液体重新进HPLC测放射化学纯度，测活度，计算放化产率。

3 结果与讨论

3.1 [18F]SFB的放化合成

三步法合成[18F]SFB(图2)介绍如下：

第一步是氟的亲核取代反应，在保证严格无水的条件下，产率一般较高。其中温度是很重要的影响因素，温度越高，氟化时间越短，但副反应发生的几率也越高，因此一般反应温度为90–100℃，另外前体的量的多少直接决定了第二步需要的碱和酸的多少。我们采用无水乙腈作为溶剂，前体投量5–8 mg，此时标记率为95% (n≥5)。

图2 [18F]SFB的三步法合成步骤Fig.2 Three-step radiosyntheses of [18F]SFB.

第二步，唐刚华等[29]用氢氧化四丙基胺来水解，生成四丙基铵盐，实现一锅法合成[18F]SFB，可采用模块实现自动化合成。而Wüst和Azarian等[30,31]对不同前体用三氟乙酸作为水解试剂。我们采用氢氧化钠使之完全水解，生成[18F]对氟苯甲酸钠，加入过量盐酸中和，生成[18F]对氟苯甲酸([18F]FA)，再用C18柱除去未反应前体和18F离子。

第三步，Vaidyanathan等[26,27]用DCC作为活化剂，反应时间长达30 min；后采用DSC，缩短了反应时间，但活化温度高达 150℃，且所得产物混有中间体碳酸盐，须进行正相HPLC分离。我们采用离子化试剂TSTU，反应温度为90–95℃，时间仅需5 min，还可用SPE柱代替HPLC实现产品分离。

三步反应的总放化产率 25%(未经衰变校正)，合成时间70 min，放射化学纯度>98%(图3)。

Matthias Glaser等[32]2009年发明的二步法合成[18F]SFB(图 4a)，用催化剂(diacetoxyiodo) benzene实现了从[18F]FBA到[18F]SFB的一步直接合成，大大缩短了反应时间；而Ran Yan等[33]用一步法合成了[18F]SFB(图4b)，产率13%–23%。这两种方法均在实验室摸索阶段，未放大生产，但他们代表了合成[18F]SFB的新方向。

图3 经过sep-pak分离后的[18F]SFB放射性HPLC图谱(采用分离多肽程序)Fig.3 HPLC radio chromatogram of [18F]SFB using gradient of peptide preparation after sep-pak separation.

图4 二步法(a)和一步法(b)合成[18F]SFBFig.4 Two-step (a) and one-step (b) radiosyntheses of [18F]SFB[32,33].

3.2 与多肽的偶联(图5)

SFB标记多肽的稳定性好，不易脱氟，放化产率高，通过[18F]SFB标记了不少多肽，诸如人C肽(Human C-peptide)[34]，神经紧张素肽(Neurotensin)[35]，钙磷脂结合多肽-V(Annexin-V)[36]，胰岛素(Insulin)[37]，蛙皮素(Bombesin)[38]，血管活性肠肽(Vasoactive intestinal peptide)[39]，RGD多肽(RGD peptides)[40,41]以及奥曲肽(Oligonucleotides)[42]。影响[18F]SFB标记多肽的因素主要有反应体系、多肽浓度、pH值、温度等。反应体系一般有两种：二甲基亚砜/N,N-二甲基甲酰胺/N,N-二异丙基乙胺(DMSO/DMF/DIPEA)，以及硼酸缓冲液/乙腈。多肽AcTZ14011在硼酸缓冲液中溶解性很好，我们选用后者作为反应溶剂。在理论上，多肽浓度越高，标记率也高，但考虑成本因素，本文实验用100 µg溶于150 µL缓冲液，[18F]SFB溶解于50 µL乙腈，考察pH值、温度对标记率的影响。

图6是反应条件对[18F]SFB标记多肽的影响。由图6a，该标记反应对pH依赖很严重，pH靠近中性，几乎不反应；pH=9.2时，大部分SFB都发生水解形成了[18F]FA，pH=8.5的产率最高，为37.6±2.1%(n=3)。由图 6b，温度越高，标记率也越高，但是温度太高容易造成多肽的分解。我们的反应温度定为42℃。由此，反应的最佳参数为：温度42℃，[18F]SFB溶于50 µL乙腈，100 µg多肽溶于150 µL pH 8.5 的缓冲液。

图5 [18F]SFB偶联多肽示意图Fig.5 Scheme of [18F]SFB conjugated with peptide AcTZ14011.

图6 pH(a)和温度(b)对标记率的影响Fig.6 pH dependence of the RCY of labeling with [18F]SFB (a) and influence of the reaction temperature (b).

图7 经制备后的标记多肽[18F]FB-AcTZ14011 (a)和未标记多肽(b)的HPLC图谱Fig.7 HPLC chromatogram of the puri fi ed [18F]FB-AcTZ14011. (a) and HPLC profiles of AcTZ14011 (b),using the gradient of peptide preparation.

3.3 质量控制

HPLC纯化后的标记多肽[18F]FB-AcTZ14011溶液经过旋干，加入生理盐水注射液后再调节pH值，经过0.22 µm微孔滤膜过滤后所得溶液澄清透明。取溶液进放射性HPLC测其放射化学纯度>96%，并且标记多肽的放射性峰与未标记多肽的UV峰完全分开(图7)。经过6 h标记多肽在PBS中的稳定性仍>90%。

4 结论

本研究以[18F]SFB 为中间体，对多肽AcTZ14011进行了18F标记，整个合成时间为180 min (包括旋转蒸发，HPLC分离等各项操作)，产率为3%(未经衰变校正)，标记的多肽溶液澄清透明，放化纯度>96%，为随后进行生物学评价打下了基础。

致谢本研究所用18F由上海复旦大学附属肿瘤医院PET中心提供，对张勇平工程师和王明伟博士的热心帮忙表示感谢！

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