高效液相色谱法测定血府逐瘀片中赤芍所含芍药苷的含量

刘立辉（辉南县人民医院，吉林辉南135100）

高效液相色谱法测定血府逐瘀片中赤芍所含芍药苷的含量

刘立辉
（辉南县人民医院，吉林辉南135100）

血府逐瘀片；高效液相色谱法；赤芍；芍药苷；含量

血府逐瘀片是由赤芍、桃仁、当归、川芎等11味中药组成的复方制剂，具有活血祛瘀，行气止痛之功效。主要用于瘀血内阻，头痛或胸痛，内热瞀闷，失眠多梦，心悸怔忡，急躁善怒等症。收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第五册59页WS3 B－0928 91收载的“血府逐瘀胶囊”，现经剂型改革为“血府逐瘀片”，原药品标准中没有含量测定项，为了更好的控制产品内在质量，本实验采用高效液相色谱法测定赤芍中芍药苷的含量，该方法能有效地控制该制剂的质量。

1 方法

1.1 仪器与试药岛津SPD-10AVP高效液相色谱仪（日本）；芍药苷对照品由中国药品生物制品检定所提供，批号110736-200422，乙腈为色谱纯，甲醇为优级纯，其它试剂均为分析纯。

1.2 色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.05%磷酸溶液（16∶84）为流动相；检测波长为230 nm。理论板数按芍药苷峰计算，应不低于3 000。

1.3 对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL中含0.05 mg的溶液。

1.4 供试品溶液的制备取本品1 g，研细，精密称定，精密加入70%乙醇溶液50 mL，超声处理（250W，50 KHz）30min，放冷，滤过，精密量取续滤液25 mL，蒸至近干，残渣加水30 mL溶解，加氯仿提取2次，每次25mL，弃去氯仿液，用水饱和正丁醇提取5次，每次25 mL，合并正丁醇提取液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至25 mL量瓶中，加甲醇稀释刻度，摇匀，即得。

2 方法学考察

2.1 理论板数的确定按上述方法测定，得到芍药苷对照品及样品的色谱图。计算芍药苷峰的理论板数（N）如下：N＝5.54×5.54×（10 241.834。此条件下，芍药苷与其相邻的峰分离完全，分离度符合规定，参考中国药典2000年版一部赤芍项下有关规定，暂定其理论板数按芍药苷峰计不得低于3 000。

2.2 测定波长的选择经测定芍药苷对照品甲醇溶液的紫外吸收光谱的最大吸收波长为230 nm，故选取230 nm为测定波长。

2.3 流动相的选择试验比较了（1）25%的甲醇溶液和（2）乙腈－0.05%磷酸溶液（16∶84）两种流动相，结果表明，流动相（2）可获得更好的分离，且保留时间较短，柱效高。

2.4 脱脂试剂的选择试验比较了乙醚、氯仿两种试剂，从色谱图上看效果都比较好，但氯仿比乙醚脱脂更彻底，故选定氯仿为脱脂试剂。同时将脱脂后的溶液蒸干，经甲醇5mL溶解残渣，测其色谱图无芍药苷峰检出，故可以认定脱脂过程中，测定组分基本无损失。

2.5 氯仿脱脂次数的考察试验比较了脱脂次数1，2，3次，结果2次可以达较好的脱脂效果，故选取脱脂2次。

2.6 提取方法的考察试验比较了（1）正文方法；（2）甲醇超声提取30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水溶液，上D-101大孔吸附树脂柱，水洗50 mL，氨试液2mL洗柱，水洗至中性，再用50%乙醇洗脱，收集洗脱液50mL，蒸干，定容于25mL。结果方法（1）和（2）测得的含量基本一致，但方法（1）色谱图较（2）更清晰。故选定方法（1）为本法的测定方法。

2.7 标准曲线的制备取芍药苷对照品10 mg，置25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，分别精密量取上述溶液1，2，5，8，9 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，分别取10μL注入液相色谱仪中，测定其峰面积积分值，以进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y＝698 923X－216 38，r＝0.999 9，表明芍药苷进样量在0.4～3.6μg范围内与其峰面积有良好的线性关系，考察结果见表1。

进样量／（μg／mL）0.04 0.08 0.2 0.32 0.36进样量／μg 0.4 0.8 2.0 3.2 3.6峰面积／A 257 709.391 539 488.625 1 368 711.000 2 232 755.750 2 482 374.500

结果表明，芍药苷在0.4～3.6μg的范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.8 阴性对照试验取不含白芍的阴性对照品适量，依上述方法测定。结果，白芍阴性样品的色谱图在芍药苷峰相应的保留时间附近无干扰峰出现。

2.9 稳定性试验取本品3 g（批号040901），按正文拟定的含量测定方法测定，在0，2，6，10，16 h进样，测定，结果见表2。

表2 稳定性试验结果

如表2所示，在16 h内，供试品溶液中芍药苷的含量基本稳定。

2.10 精密度试验精密吸取上述供试品溶液10μL（批号040901），注入液相色谱仪，重复5次，按色谱峰面积值计，结果¯x＝483 362，RSD＝0.21%，表明其峰面积基本一致，所用仪器精密性良好。

2.11 重现性试验取同一供试品（批号040901），依正文方法独立测定5次，结果¯x＝1.62 mg／片，RSD＝0.98%，表明该方法重现性很好。

2.12 回收率试验精密称取同法测定已知含量的供试品（批号040901）（含量：1.62 mg／片）6份，每份1 g，精密称定，置50 mL量瓶中，再分别加入芍药苷对照品溶液（1 mL溶液中含0.2 mg芍药苷）5，5，15，15，25，25 mL至上述瓶中，精密称定，置锥形瓶中，再分别精密加入70%乙醇溶液50 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min（250W，50 KHz），取出，放冷，称定重量，补足损失的70%乙醇量，滤过，精密量取续滤液25mL，蒸至近干，残渣加水30 mL溶解，加氯仿提取两次，每次25mL，弃去氯仿液，用水饱和正丁醇提取5次，每次25 mL，合并正丁醇提取液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至25mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，分别精密吸取上述溶液和对照品溶液（精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.05 mg的溶液，即得。）各10μL，注入液相色谱仪，测定，计算回收率。结见表3。

表3 回收率试验结果

结果表明，本法回收率在98.4%～100.2%之间，平均回收率99.2%，RSD为0.66%，说明加样回收良好。准确度较高。

3 样品的测定结果

取3批样品按正文方法条件测定，结果见表4。

表4 样品含量测定结果

4 原料药材的含量测定结果

依正文方法测定3批药材含量，结果见表5。

表5 药材含量测定结果

如表5所示，3批白芍含量均符合《中国药典》2000年版一部相关规定。可用于该制剂投料。并定为药材含量不得低于0.8%。

5 含量限度的确定

通过对3批样品和3个产地药材的含量测定可知，药材平均含量为0.887%；样品平均含量为1.617mg／片，考虑到原料药材本身含量的变化及生产中的波动，取其测定均值的80%为限度，暂定本品每片含赤芍以芍药苷（C23H28O11）计，不得少于1.29mg。

［1］谢秀琼.临床新药制剂开发与应用［M］.北京：人民出版社出版，1999：341.

R285.5

A

1007－4813（2010）05－0772－02

2010－06－21）

刘立辉（1972－），男，大学本科，主管药师。研究方向：中药制剂与质量研究。