Eca109细胞光动力损伤效应的傅里叶变换红外光谱分析*

刘婉华，刘 健，刁振琦，李云涛，唐伟跃

1)郑州大学物理工程学院郑州450001 2)郑州大学信息工程学院郑州450001

光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)是光敏剂进入人体后，有选择地聚集在肿瘤组织上，经特定波长激光激发，在肿瘤组织内发生一系列的光化学反应，产生多种活性氧物质，如单线态氧、超氧阴离子及羟自由基等，作用于生物分子中的氧化敏感基团，导致其氧化失活，从而对蛋白质、核酸和脂类生物大分子产生破坏作用，使细胞的结构和功能受到严重影响，导致细胞凋亡或坏死，达到治疗肿瘤的目的。但是目前对PDT杀伤肿瘤细胞的作用机制还未完全认识。傅立叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectrum，FTIR)主要研究分子振动光谱和转动光谱，其光谱强度可反映样本生化组成的定量信息，而光谱频率则反映样本分子的空间结构、化学键等定性信息。FTIR的特点是扫描速度快，光通量大，分辨率高，信噪比高，测定光谱范围宽，在分子生物学和临床医学研究领域有着广泛的应用。作者用FTIR技术分析光敏剂血卟啉单甲醚(hematoporphyrin monomethyl ether，HMME)的光敏化作用对人食管癌细胞株Eca109生物大分子核酸、蛋白质及脂类的微观结构的影响，从分子水平探讨PDT对肿瘤细胞的损伤机制。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器 HMME购自上海红绿光敏剂研究所有限公司;Eca109购自中国科学院上海细胞生物学研究所;RPMI 1640培养液购自美国Gibco公司。美国Nicolet IR200傅里叶变换红外光谱仪;德国CHRIST冰冻干燥机，型号ALPHA1-2LD;光敏剂激发光源半导体激光器，英国DIOMED公司，波长630 nm，输出功率2 W。

1.2 Eca109细胞的PDT处理 Eca109于含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中传代、培养，取对数生长期的细胞用于实验，制备密度为1×105mL－1的单细胞悬液，接种于培养板中，分组培养，每组3个复孔。PDT组:将培养板放入CO2培养箱中培养 24 h，待其贴壁后，加入 5 mg/L的HMME，继续培养6 h，然后用半导体激光器垂直照射培养板，光剂量15 J/cm2，继续培养6 h，收集细胞进行红外光谱的采集。对照组不加光敏剂、不照射。

1.3 FTIR的采集及处理 将细胞制成溴化钾压片，放置于仪器中进行检测。参数设定:光谱扫描范围400 ～4 000 cm－1，分辨率4 cm－1，扫描累加次数128次。所得光谱均用Nicolet公司的Omnic 5.0专用软件处理。采用Origin 7.5软件对蛋白质酰胺Ⅰ进行去卷积和二阶导数处理，确定重叠峰子峰个数和峰位置，并对酰氨Ⅰ带及其子峰进行曲线拟合，根据各子峰占整个酰胺Ⅰ带面积的比例计算蛋白质各二级结构的含量。

2 结果与讨论

2.1 光谱图 Eca109特征峰归属见表1［1-3］。2组的红外光谱图见图1。可以看出，2组光谱谱型、谱峰和位置都存在很大的差异。

表1 Eca109红外光谱特征峰及归属

图1 2组红外光谱图

2.2 蛋白质光动力损伤后的谱带分析

2.2.1 蛋白质分子C-O(H)伸缩振动谱带 1 161 cm－1是蛋白质C-O(H)键的伸缩振动谱带，它主要来自蛋白质分子中的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基C-O(H)基团的伸缩振动，光动力损伤后峰值向低波数频移到1 158 cm－1。分子中C-O(H)基团一般与其他基团或分子形成氢键，吸收波数的频移说明C-O(H)受约束程度降低，氨基酸残基的C-O(H)基团某些氢键断裂，氢键体系发生变化［4］。对蛋白质来说，基团的损伤必然导致分子空间构象受到破坏，蛋白质变得松散。蛋白质侧链基团的损伤主要受单线态氧作用，酪氨酸、色氨酸都含有芳香环，而单线态氧主要损伤芳香环［5］，此外单线态氧还可以作用于色氨酸的吲哚环［6］。

2.2.2 酰胺Ⅰ带 酰胺Ⅰ带(1 600～1 700 cm－1)常用来分析蛋白质的二级结构，它由代表羰基伸缩振动的几个子带组成，包含有α螺旋、β折叠、无规卷曲、β转角等［7］，各组分的谱带通常相互叠加在一起。图2是结合去卷积、二阶导数谱对原谱进行曲线拟合得到的谱图。2组二级结构相对含量见表2。

图2 酰胺Ⅰ带二阶导数谱

表2 2组蛋白质二级结构的指认［8］和平均相对百分含量值 %

可以看出，当Eca109细胞光动力损伤后，蛋白质的α螺旋含量减少12.4%，β折叠含量减少13.5%，表明蛋白质主链的有序结构减少。而无规卷曲和β转角的含量分别上升49.6%和43.1%，提示蛋白质无序性增加，蛋白质主链构象趋于松散。主链构象发生变化的原因是光敏剂受激光照射后，产生的单线态氧具有较强的氧化性，破坏了形成α螺旋和β折叠的链内和链间氢键体系，α螺旋和β折叠展开，被卷曲在蛋白质分子内的色氨酸等疏水芳香族残基趋向蛋白质表面［9］。说明光动力作用对Eca109细胞的蛋白质二级结构造成明显损伤，蛋白质空间构象的改变使其失去活性，其结果影响细胞的结构和功能，从病理学损伤效应上表现为细胞凋亡和坏死。

2.3 核酸光敏损伤后的谱带分析 FTIR光谱中，谱带969 cm－1是细胞内磷酸化蛋白和核酸的磷酸单酯二价阴离子的对称伸缩振动，反映细胞中核酸或磷酸化蛋白质的含量。磷酸二酯基团的对称伸缩振动 νs(PO2－)谱带峰位于 1 084 cm－1附近，反对称伸缩振动νas(PO2－)谱带对应于 1 244 cm－1。光动力损伤后969 cm－1峰变成了以975 cm－1为中心的一个宽峰，它对应于各种各样的由于DNA链断裂产生的多核苷酸。νs(PO2－)谱带 1 084 cm－1峰向高波数移动，由二阶导数谱可知它变成了由1 089、1 078及1 072 cm－1组成的一组小峰，峰值强度均大幅下降。νas()谱带1 244 cm－1峰的吸收强度也有所下降。谱带反映核酸骨架上磷酸二酯基团结构的变化，在完全无氢键时，磷酸二酯基团的反对称伸缩振动在1 260 cm－1处，在完全氢键化后在 1 240 cm－1处［4］。1 244 cm－1峰向高波数移动，表明核酸骨架上磷酸二酯基团中形成氢键的程度减弱，氢键化程度的降低使细胞的核酸骨架从无序趋向于有序，细胞突变和异构化受抑。磷酸二酯基团的吸收带峰值的频移和强度减小，说明核酸分子的构象发生变化、含量降低，光动力损伤作用造成磷酸二酯基团的损伤，使 DNA单、双链断裂，癌细胞DNA复制能力被抑制，由此导致细胞凋亡。

2.4 脂质光敏损伤后的谱带分析 1 740 cm－1峰反映了细胞膜磷脂中羰基C=O基团的伸缩振动，峰位向高波数移动，吸收峰强度减弱，表明磷脂的构象发生改变，碳氢链间相互作用增强［10］。谱带2 858和2 873 cm－1峰属于磷脂脂质中 CH2、CH3基团的对称伸缩振动，而谱带2 927和2 952 cm－1峰属于CH2、CH3基团的反对称伸缩振动。CH2和CH3基团伸缩振动谱带反映膜磷脂分子内碳氢链构象的无序化程度［11］。光动力损伤后，2 858 cm－1峰峰值明显减弱，峰位向高波数位移5 cm－1，说明磷脂分子碳氢链构象的无序化和扭式构型增加，细胞膜上多种功能基团结构受损，从而使细胞膜完整性和流动性下降，膜功能受到严重影响。而细胞膜磷脂参与了细胞凋亡的发生，因此推测光动力作用所产生的单线态氧、羟基自由基等与细胞膜磷脂发生氧化反应，引起细胞膜磷脂结构改变，这可能是光动力作用诱导细胞凋亡的分子机制之一。

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