应用重组改良型人膜联蛋白检测动脉粥样硬化斑块的实验研究

宋丽萍 ，华子春 ，张 欣 ，邢海燕 ，轩 楠

（1.辽宁医学院附属第一医院核医学科，辽宁 锦州 121000；2.南京大学医药生物技术国家重点实验室，江苏 南京 210093）

动脉粥样硬化（AS）的临床表现和预后主要取决于斑块类型而不是其大小。急性冠状动脉综合征（不稳定心绞痛、心肌梗死和心源性猝死）是导致冠心病患者死亡的主要因素，而不稳定斑块破裂、血栓形成则是导致急性冠状动脉综合征的关键机制。因此，在体外确定不稳定斑块，以求早期采取必要的措施控制AS的进一步发展具有重要的应用价值。

近年来国内外一些学者根据AS不稳定斑块形成过程中存在大量的凋亡细胞，进行了凋亡显像的研究。在AS斑块组织中，内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞及淋巴细胞都存在着死亡过程，而死亡细胞的发生都是通过凋亡进行的。细胞凋亡在AS的病理生理过程中起重要作用。膜联蛋白V（Annexin V）是人体内源性蛋白质，可与凋亡早期细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸特异性结合（Phosphatidyserine，PS）[1]。 因此，用99mTc标记Annexin V可进行AS斑块的细胞凋亡显像的研究。由南京大学新药生物技术国家重点试验室对Annexin V进行重组研究的基础上，将Annexin V的N端接入一段10个组氨酸（Histidine）结构的多肽，从而构建内源性锝鳌合位点[2]，在不改变Annexin V生物活性基础上，提高其与99mTc的结合效率及稳定性。本研究通过99mTc直接标记 H-Annexin V，探讨99mTc-H-Annexin V对兔AS模型显像的价值。

1 材料和方法

1.1 材料

实验动物：健康雄性大耳白兔7只，体重2.5～3.5kg，均由辽宁医学院动物实验中心提供。

试剂H-Annexin V由南京大学新药生物技术国家重点试验室提供。99mTcO4-由北京原子高科核技术有限公司提供。其余试剂均为国产分析纯。

仪器SPECT为GE公司生产的infiniaⅡ双探头可变角度带符合线路的SPECT。GC-911型γ计数器为合肥中佳光电仪器公司。

1.2 方法

1.2.1 兔AS模型的制备

7只雄性大耳白兔，体重2.5～3.5kg。随机分为模型组和正常对照组，模型组4只（其中1只用于模型对照研究），正常对照组3只。模型组给予高脂饮食 （内含2%的胆固醇和5%猪油），正常对照组给予正常饲料。饲养2周后模型组行降主动脉球囊拉伤。10%水合氯醛（3ml/kg体重）静脉注射麻醉动物，腹股沟区触摸股动脉搏动，纵向切开皮肤，分离皮下组织，钝性分离股动脉、静脉和神经。切开股动脉，球囊导管插入股动脉，上行插入约30cm后，给球囊注入生理盐水0.2ml，向下拖拉球囊至髂总动脉分叉处，反复3次。缝合动脉切口和皮肤，青霉素80万单位腹腔注射3d，防止感染。术后继续给予含2%胆固醇和5%猪油的高脂饲料，15周后进行主动脉在体和离体显像。

1.2.299mTc-H-Annexin V的制备

取冻干品H-Annexin V 500μg以生理盐水溶解，加入缓冲液 （50mm PBS，140mm NaCl，5%甘油，pH 值为 7.6），再加入约40μg还原剂SnCl2，然后在其中加入37～55.5MBq/kg99mTc进行直接标记，混匀，条件均为常温下震荡，37°孵化25min，取出自然冷却到室温。

1.2.399mTc-H-Annexin V的标记率的测定

采用纸层析法测定标记率，取标记混合物用新华1号层析纸，丙酮作展开剂，点样后上行展开一段距离，取出晾干，然后从原点下0.5cm开始，每间隔1cm将层析纸分段剪裁，用γ计数器测定各段放射性计数。

1.2.499mTc-H-Annexin V活体兔AS斑块显像

取15周的兔进行显像。以10%水合氯醛（3ml/kg体重）麻醉兔后固定，自耳缘静脉注射99mTc-H-Annexin V 37～55.5MBq/kg。注射后10、30min和1、2h行静态平面前后位及后前位显像。显像仪器为美国GE公司生产的infiniaⅡ双探头可变角度带符合线路的SPECT仪，配低能高分辨型准直器，能峰140keV，窗宽20%。矩阵128×128，放大倍数2.0。视野包括腹主动脉、部分肝脾、双肾和膀胱。并计算2h两组动物降主动脉靶/非靶（T/NT）比值。

1.2.5 兔AS斑块离体血管显像及血管片段放射性测定

活体显像后，注射过量的10%水合氯醛处死动物，进行解剖。小心暴露动物心脏至髂总动脉分叉之间的胸腹主动脉，清除附着于动脉上的脂肪与组织，取出降主动脉。沿腹侧纵向剪开动脉壁，以生理盐水冲洗干净后的离体血管按斑块的分布剪成若干等份，每段血管用电子天平称质量并用γ计数器测定放射性计数，计算每毫克组织放射性强度（cpm/mg）。

1.2.6 病理结果

将离体血管标本经石蜡包埋、切片，行HE染色，在光学显微镜下观察。

1.2.7 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，所有数据用x±s表示，T/NT的比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AS兔模型的制备

经球囊损伤血管内皮及高脂饮食后，15周AS兔模型制备完成。光学显微镜下可见薄的纤维帽形成，大的脂质坏死中心，细胞外基质及平滑肌细胞很少，内膜可见有少量的泡沫细胞（图1），正常免腹主动脉内皮HE染色见图2。

2.2 99mTc-H-Annexin V的标记结果

标记率为95.23%～96.15%，平均为95.82%±0.28%。

2.3 兔AS活体核素成像结果

模型组兔腹主动脉在注射99mTc-H-Annexin V后10min可见沿主动脉走行的放射性条状影，随着时间延长，放射性摄取呈不均匀性增加，2h显影较为清晰。而对照组兔在注射后10min见主动脉显影，但随着时间的延长，放射性逐渐消退，2h主动脉显影不清晰。模型组注射99mTc-H-Annexin V后 2h T/NT 比值为 2.68±0.25，明显高于对照组（1.57±0.24，t=5.44，P＜0.01）。 1 只模型对照组兔注射99mTcO4-后 10min 至2h，腹主动脉显影均不清晰（图3～8）。

2.4 离体血管显影结果

注射99mTc-H-Annexin V后2h处死模型组兔，分离出降主动脉，肉眼可见降主动脉内膜面大小不等的淡黄色斑块样突起。离体主动脉显像可见对应部位放射性浓聚。含AS斑块血管片段的放射性摄取为（63.33±14.11）cpm/mg，明显高于非斑块的血管片段（21.75±8.30）cpm/mg（t=9.53，P＜0.01）（图 9）。

图1 兔腹主动脉AS HE染色切片图，可见大的脂质坏死中心，并有薄的纤维帽。 图2 正常兔腹主动脉内皮HE染色切片图。Figure 1. Rabbitabdominalaorta atherosclerosis HE stain showed:large lipid necrotic center and thin fiberous cap.Figure 2. Normal rabbit abdominal aorta HE stain.

图3 实验组30min：可见降主动脉清晰显影。 图4 实验组2h：可见降主动脉仍清晰显影。 图5 正常对照组30min，可见降主动脉显影不清晰。 图6 正常对照组2h，可见降主动脉显影不清晰。Figure 3. The image showed that the descending aorta was clear in experiment group at 30 minutes. Figure 4. The image showed that the descending aorta was clear in experiment group at 2 hours. Figure 5. The image showed that descending aorta was not clear in control group at 30 minutes.Figure 6.The image showed that the descending aorta was not clear in control group at 2 hours.

图7 兔降主动脉AS模型99mTcO4-显像结果：30min时主动脉影像不清晰。 图8 兔降主动脉AS模型99mTcO4-显像结果：2h主动脉影像仍不清晰。 图9 AS兔降主动脉离体标本显像，可见降主动脉清晰显影。Figure 7. The rabbit abdominal aorta atherosclerosis99mTcO4-imaging showed:the descending aorta image was not clear at 30 minutes. Figure 8. The rabbit abdominal aorta atherosclerosis99mTcO4-imaging showed:the descending aorta image was not clear at 2 hours. Figure 9. The rabbit abdominal aorta atherosclerosis in vitro imaging:descending aorta image was clear.

3 讨论

近年来国内外许多学者已根据AS形成过程中某些相关分子和细胞，进行了放射性核素显像的研究。也有一些学者根据AS不稳定斑块形成过程中存在大量的凋亡细胞，进行了凋亡显像的研究。

在AS斑块组织中，内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞及淋巴细胞都存在着死亡过程，而死亡细胞的发生都是通过凋亡进行的。Annexin V是人体内源性蛋白质，含有319个氨基酸，分子质量为35.8×103，折叠成平面环行结构，称之为内联蛋白重叠[3]，可与凋亡早期细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸特异性结合。由此，放射性标记的Annexin V最早被研制成细胞凋亡显像剂，用于活体监测及定量测定细胞凋亡。Johnson等[1]报道，99mTc-Annexin V在猪AS模型中显示冠状动脉的斑块，免疫组化结果提示，平滑肌细胞凋亡显像显示的病变动脉段的细胞凋亡率明显高于周围正常动脉段及对照组的动脉段。同时，Buck等[4]体外放射性核素显像表明，99mTc-Annexin V的摄取量与主动脉AS部位血管损伤的严重程度、巨噬细胞凋亡的数量成正相关。

由于细胞凋亡与AS斑块的不稳定密切相关，因此用放射性核素标记的Annexin V进行AS斑块的无创伤性检测是可行的。

有研究报道：多种核素曾被用于标记Annexin V，包括99mTc、123I、124I、125I、18F 等， 而99mTc 制备容易、 价格低廉， 适合SPECT显像[5-6]。然而，直接用99mTc标记的Annexin V将产生一些变性蛋白，且标记率较低。以HYNIC结合放射性核素的方式标记率高，但标记过程较直接标记法复杂，肾脏的摄取高。H-Annexin V是在Annexin V的生物结构中寻找活性区域并进行克隆得到的保持甚至于超过Annexin V生物活性的一种多肽，既保持了Annexin V对于PS的强亲和力，又引进了更多的结合位点，提高了其与99mTc的结合效率及稳定性，而且标记方法更加简单，稳定性好[2]。

本研究应用99mTc-H-Annexin V进行兔AS活体显像，可见AS血管对99mTc-H-Annexin V的摄取明显高于正常血管，显像结果良好。AS血管标本的离体显像及其片段的放射性摄取测定也表明AS病灶与Annexin V的大量结合。因此，99mTc-H-Annexin V可用于无创检测AS斑块。

本研究的局限性：本实验动物数量较少，而模型对照组只有1只实验动物，所以没有进行统计学处理，还需大量实验进行验证。

[1]Johnson LL,Schofield L,Donahay T,et al.99mTc-Annexin V imaging for in vivo detection of atherosclerotic lesions in porcine coronary arteries[J].J Nucl Med,2005,46:1186-1193.

[2]贾支俊，冯雪凤，杨翔，等.99Tcm-H-Annexin V动物体内分布及显像[J]. 中国临床医学影像杂志，2008，19（1）：56-57.

[3]王峰，王自正.细胞凋亡显像的研究现状及发展前景[J].国际放射医学核医学杂志，2007，31（1）：1-5.

[4]Buck AK,Halter G,Schinmeister H,et al.Imaging proliferation in lung tumors with PET[J].J Nucl Med,2003,44(9):1426-1431.

[5]Lahorte CM,Vanderheyden JL,Steinmetz N,et al.Apoptosis-detecting radioligands:current state of the art and future perspectives[J].Eur J Nucl Med Mol Imaging,2004,31:887-919.

[6]Zijlstra S,Gunawan J,Burchert W.Synthesis and evaluation of a18F-labelled recombinant Annexin-V derivative,for identification and quantification of apoptotic cells with PET[J].Appl Radiat Isot,2003,58:201-207.