新病害—山核桃果实黑斑病病原菌的鉴定

张传清， 徐志宏＊， 孙品雷， 陈为民， 徐炳潮， 俞春来， 包春泉

（1.浙江林学院农业与食品科学学院植物保护系，临安 311300； 2.浙江省杭州市森林病虫防治站，310009；3.浙江省临安市森林病虫防治站，311300； 4.浙江省淳安县森林病虫防治站，311700；5.浙江省桐庐县森林病虫防治站，311500）

胡桃科（Juglandaceae）山核桃属（Carya）植物是著名的干果树种，浙江山核桃（C.cathayensis）具有经济价值高、营养丰富等特点，发展前景广阔。随着人民生活水平的提高，山核桃越来越受到人们的重视，产品供不应求，仅浙江临安的栽培面积就超过2.5万hm2。2007年，浙江杭州地区（临安、淳安和桐庐市）、安徽宁国等地山核桃的果实出现了一种新的病害—果实黑斑病，农户形象地称之为山核桃“黑籽病”或“花籽病”。该病害于幼果期开始表现症状，起初在幼果上形成小黑点，发展成直径1～2 cm左右的近圆形稍凹陷的黑斑，后病斑不断扩大连接成大片不规则形状的黑斑。至山核桃成熟时除了在果皮上形成大片黑斑外，还会导致内部果肉发黑，口感苦涩，严重影响山核桃的产量和品质。

目前该病害有逐年加重的趋势，2008年浙江临安、淳安和桐庐等山核桃主产区的平均病果率达5%，严重的地区超过20%。但还没有该病害病原物的相关报道，类似病害在胡桃科作物上也未见报道，由此导致对该病害的防治十分盲目，无法采取针对性的措施。因此，作者于2008年从不同地区采集山核桃病果，进行了病原菌分离和鉴定。

1 材料与方法

1.1 病原菌分离、纯化与培养

2008年6－8月从不同地区采集具有典型症状的病果（图1），带回实验室进行常规组织分离。分离物采用常规方法进行单孢纯化，纯化获得的菌株在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上培养，观察其培养特征，7 d后用无菌水洗下孢子，显微观察其形态特征。

1.2 分离物的回接与再分离

采用离体幼果接种法。从无该病发生的地区采集健康的山核桃幼果，将其放置于直径9 cm的培养皿内，底部用含无菌水的滤纸保湿。随机选取HT－3、HT－38和HT－16等10个菌株，在PDA培养基上预培养7 d后用含0.01%吐温－80的无菌水洗下孢子并调节浓度至106个／ML，用喉头喷雾器将上述分生孢子悬浮液喷在山核桃幼果表面。以含0.01%吐温－80的无菌水为对照（CK）。每个菌株3次重复，每次重复接种2颗果实。接种后的果实放在25℃，L∥D＝12 h∥12 h，85%RH条件下培养。果实发病后进行病原菌的再分离。

1.3 r DNA ITS扩增所用引物

采用扩增真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）的通用引物［1］，由上海生工合成。上游引物ITS1（5′－TCCGTAGTGAACCTGCGG－3′），下游引物ITS4（5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′）。

1.4 DNA提取

各菌株在PDA培养基上于25℃黑暗条件下培养7 d后，用灭菌载玻片刮取菌丝。DNA提取采用UNIQ－10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒（上海生工）。

1.5 ITS的PCR扩增和序列测定

PCR扩增条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，32个循环；72℃保温10 min［1］。DNA序列测定委托上海英骏有限公司进行。测得的序列通过BLAST进行比对。

图1 山核桃果实黑斑病的田间症状

2 结果与分析

2.1 分离物的培养和形态特征

从不同地区不同时间采集的病果都分离得到了同一种真菌，该菌在PDA培养基上形成白色菌落，具明显的同心轮纹。分生孢子盘球形，直径108～220μm。分生孢子长梭形，直或弯曲，（22.6～29.9）μm×（6.1～9.0）μm，5个细胞、中间3个有色孢（上部2个为黑褐色、下部1个为淡橄榄色），孢子顶生2～3根附属丝、多为3根，15.8～33.6μm，附属丝末端无匙状膨大（图2）。根据上述培养性状和形态特征将其初步鉴定为小孢拟盘多毛孢（Pestalotiopsismicrospora）。

图2 山核桃果实黑斑病病原菌的分生孢子形态

2.2 分离物的致病性

HT－3、HT－38和 HT－16等随机选择的10个菌株通过离体幼果接种7 d后都出现了明显的症状：果面上形成不规则形状的黑斑（图3）。该症状与田间病果一致，而对照果实保持健康，没有出现任何症状。

图3 山核桃果实黑斑病病原菌的人工接种结果

2.3 病原菌的ITS序列

HT－3、HT－38和 HT－16等10个菌株经PCR后都获得500 bp左右的片段，测序结果表明供试的菌株间序列完全一致。本病原菌的ITS序列（GenBank登录号：FJ947050）与小孢拟盘多毛孢（P.microspora）多个菌株（GenBank登录号：FJ459951.1，FJ459950.1，FJ459949.1和EU279435.1）的序列一致性达100%。

综合上述培养性状和分生孢子的形态特征，将引起山核桃果实黑斑病的病原菌鉴定为小孢拟盘多毛孢（P.microspora）。

3 讨论

前人研究认为分生孢子中间色胞颜色类型即淡色（褐色至橄榄色）和暗色（暗褐色或煤烟色至褐色）是拟盘多毛孢属首要的分类特征，分生孢子顶端附属丝末端匙状膨大与否是第二重要的分类特征，此外分生孢子的长度和宽度等也是重要的分类特征［2－3］。韦继光等提出单纯依赖形态特征鉴定拟盘多毛孢的种类会存在较大的误差，而应该综合形态学和分子系统学特征进行界定［4］。

本研究于不同时间从采自不同地区山核桃果实黑斑病病果上都分离出了同一种优势的真菌，其在接种时能引起与自然发病相同的症状，说明本研究获得的分离物是山核桃果实黑斑病的病原菌。该真菌在PDA培养基上培养特征和Pestalotiopsis一致。本研究在综合病原物的培养性状、形态特征和ITS序列后认为，山核桃果实黑斑病的病原为小孢拟盘多毛孢（P.microspora）。虽然从病果上也分离到了少量葡萄座腔菌属和链格孢属2种真菌，但它们在接种时都不能引起健康的山核桃果实发病。目前还未见其他山核桃属植物上有关Pestalotiopsis引起果实病害的报道。下一步需要对病害循环和防治措施进行针对性的研究，以解决生产上盲目防治的问题。

［1］张剑.小孢拟盘多毛孢的鉴定与除草活性物质分析［D］.保定：河北农业大学，2008.

［2］Guba E F.Monograph ofMonochaetiaandPestalotia［M］.Massachusetts：Harvard University Press，1961.

［3］刘爱荣.海南植物内生拟盘多毛孢的多样性及拟盘多毛孢属分子系统学研究 ［D］.杭州：浙江大学，2006.

［4］韦继光，徐同，郭良栋，等.根据形态学和分子系统学特征界定拟盘多毛孢属的种［J］.广西农业生物科学，2005，24（4）：304－313.