安全剂AD－67保护玉米免受单嘧磺隆药害的作用及其机理

叶 非， 付 颖＊， 徐伟钧， 王 爽

（1.东北农业大学理学院，哈尔滨 150030； 2.黑龙江省农业科学研究院，哈尔滨 150086）

磺酰脲类除草剂是目前世界上最大的一类除草剂，它作用于植物体内的乙酰乳酸合成酶（ALS），通过植物的根、叶吸收，在植物体内双向传导。由于ALS被抑制，支链氨基酸的合成受到阻碍，细胞的分裂被抑制，从而导致杂草的正常生长受到破坏而死亡［1］。目前有关磺酰脲类除草剂的专利有400多项，已商品化的有30多种。这类除草剂具有很高的除草效果，用量为2～100g／hm2，比传统除草剂的除草效果高100～1 000倍［2］。随着磺酰脲类除草剂的开发和广泛应用，一些品种对后茬作物的长残留药害问题以及除草剂残留物引起的环境问题、杂草的抗药性及药害等问题亦引起了人们的重视［3］。单嘧磺隆（N－（2’－（4’－甲基）嘧啶基）2硝基苯磺酰脲）属于磺酰脲类除草剂，是我国第一个具有自主知识产权的农药品种，它主要用于防治小麦田里播娘蒿、荠菜、麦瓶草等杂草，尤其对华北地区的难治杂草碱茅防效很好［4－5］。单嘧磺隆与酰胺类或三嗪类除草剂适量混用，用于夏玉米苗后茎叶处理，对马唐、稗草、反枝苋、藜、马齿苋等玉米田常见杂草均可有效防除。范志金等研究表明：单嘧磺隆作用靶标是乙酰乳酸合成酶，对不同玉米品种ALS活性的影响存在差异［6］。但是，单嘧磺隆易受气候和土壤因素的影响而不利于其降解，造成在土壤中残留与蓄积，并对下茬敏感作物和蔬菜产生药害。

除草剂安全剂又称除草剂解毒剂或称作物安全剂，它可以在不影响除草剂对靶标杂草活性的前提下有选择地保护作物免遭除草剂的药害，还可以用于初步解释除草剂作用靶标和作用机制［7］。近年来，随着生物化学领域分离、纯化等技术的快速发展和提高，国内外学者不仅从安全剂对作物的吸收、传导影响方面，而且从安全剂对作物体内谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽－S－转移酶（GSTs）和及除草剂靶标酶的影响等方面进行了研究，以揭示安全剂作用的本质［8］。除草剂安全剂AD－67属于二氯乙酰基噁唑烷类化合物，可使玉米免受硫代氨基甲酸酯类和酰胺类除草剂的药害，增加GSH的含量，提高GST的活性［9］，但对单嘧磺隆保护玉米的作用，目前国内外尚无报道。作者通过生物测定方法测定了AD－67对玉米的保护作用，并对玉米体内除草剂靶标酶乙酰乳酸合成酶（ALS）的活性和GSH进行了研究，初步探讨AD－67保护玉米免受单嘧磺隆药害的作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料

供试药剂：10%单嘧磺隆可湿性粉剂，南开大学元素有机所提供；安全剂AD－67，本课题组合成；TCA（三氯乙酸），北京顺义永遂化工厂；DTNB（5，5－二硫代双乙硝基甲酸）、TPP（硫胺素焦磷酸）、DTT（二硫代苏糖酸醇）、谷胱甘肽（GSH），Sigma公司产品。

供试玉米品种：东农248，东北农业大学农学院提供。

试验土壤：取自东北农业大学实验田，1～15cm无污染的耕层土壤，过筛、自然风干后使用。土壤pH为7.37，有机质含量为2.37%。

1.2 方法

1.2.1 AD－67对单嘧磺隆解毒效果试验

取定量过2mm筛的风干土，加入单嘧磺隆，配制成0、0.025、0.035mg／kg和0.050mg／kg的毒土，装入小纸杯内，平衡12h。

将精选的玉米种子用50℃左右的温水浸泡30min，12%的H2O2浸泡10min，用蒸馏水冲洗干净，再用不同浓度的 AD－67溶液（0、0.5、1、5mg／kg和10mg／kg）浸种12h左右，用蒸馏水清洗干净，放在培养箱内，26.5℃催芽24h左右（玉米芽长约1mm）。

选择芽长一致的玉米种子8粒，均匀摆放在药土表面，上覆药土1cm左右，放置培养箱内培养（温度26.5℃、湿度75%、光照与黑暗各12h循环培养），玉米生长6d后，测玉米幼苗的主根长、根鲜重、株高、株鲜重。各处理重复3次，数据采用SAS系统进行处理，进行方差分析。

1.2.2 GSH 含量的测定［10］

取玉米幼苗的叶片0.5g，加2.0mL 15%的TCA，在0～4℃下研磨，再加1.0mL 15%的TCA冲洗，放入离心管中离心（12 000r／min）20min，取1mL离心后的上清液放入试管，加2.0mL的磷酸缓冲 液 （0.5mol／L，pH ＝8），加 入 0.025mL 10mmol／L的DTNB显色，在412nm下测定A值。

1.2.3 ALS的提取和活性测定［11］

ALS的提取：取玉米幼苗的根部1.0g，加入3.0mL ALS酶提取液（0.05mol／L，pH＝7.0磷酸钾缓冲液，内含1mmol／L的丙酮酸钠，0.5mmol／L MgCl2，0.5mmol／L的 TPP，10μmol／L的 FAD），在0～4℃温度条件下研磨，转入离心管以石英砂调平衡后25 000g离心20min，取上清液2.0mL，用提取液定容至5.0mL。缓慢加入（NH4）2SO4粉末1.5g，振荡均匀。0℃下沉降2h后，25 000g、4℃下离心20min，弃去上清液，将沉淀溶于3.0mL酶溶解液（0.05mol／L pH＝7.0磷酸钾缓冲液，内含20mmol／L的丙酮酸钠，0.5mmol／L MgCl2）中，用于酶活力测定。

酶活力测定：取0.4mL酶提取液，加入0.1mL 0.05mol／L pH＝7 的磷 酸钾缓冲 液，再加入0.5mL酶反应液（0.05mol／L pH＝7的磷酸钾缓冲液，内含 24mmol／L 的丙酮酸钠，0.6mmol／L MgCl2，1mmol／L的 TPP，20μmol／L的FAD），摇匀后放入35℃恒温水域中暗处反应1h后，立即加入0.1mL 3mol／L的 H2SO4终止反应，并置于60℃恒温水域中脱羧反应15min，然后依次加入0.5mL 0.5%的肌酸和0.5mL 5%甲萘酚（溶于2.5mol／L的NaOH溶液）。60℃显色反应15min，冷却后于525nm处测定A值。

2 结果与讨论

2.1 AD－67对玉米的保护效果

AD－67单独作用于玉米植株时，对玉米根长和株高有轻微的促进作用，但各处理间差异不显著（表1，表2）。在单嘧磺隆浓度为0.025、0.035mg／kg和0.050mg／kg时，AD－67对由单嘧磺隆产生的对玉米根长和株高的抑制均有缓解作用，且在相同的单嘧磺隆浓度时，不同浓度的安全剂处理间保护效果差异显著。AD－67浓度在1mg／kg时对各浓度单嘧磺隆产生的药害解毒效果最好，该处理下，上述3个单嘧磺隆浓度玉米的根长分别为空白对照的107.3%、91.86%、77.71%；株高分别为空白对照的100.82%、100.24%、91.83%。以单嘧磺隆上述各浓度不使用安全剂的处理为对照，该处理下使玉米主根长分别增加了27.81%、28.79%和21.89%；玉米株高分别增加了12.58%、21.69%和18.88%。随着单嘧磺隆浓度的增加，AD－67保护玉米的效果降低，这与前期安全剂研究的变化规律一致［12］。

表1 AD－67对玉米主根长的保护效果1）

表2 AD－67对玉米株高的保护效果1）

2.2 AD－67对玉米叶中GSH含量的影响

单独用安全剂AD－67浸种，可提高玉米叶片GSH含量（表3）。当单嘧磺隆浓度为0.025、0.035mg／kg和0.050mg／kg时，AD－67各浓度均能增加玉米叶中GSH的含量；同一单嘧磺隆浓度下，安全剂各浓度处理间的效果差异达到极显著水平（表3）。当AD－67浓度为1mg／kg时，单嘧磺隆3个处理浓度玉米叶片中GSH含量增加最多，与无AD－67浸种的玉米叶片中GSH含量相比，分别增加了19.46%、23.55%和19.24%。结果表明：安全剂AD－67对玉米叶片中GSH含量的影响与对主根长和株高的保护效果相一致，即AD－67能够提高玉米叶中GSH含量，有利于催化GSH缀合更多的除草剂，从而快速解除除草剂的毒害作用，达到保护作物的目的［13］。

表3 AD－67对玉米叶中GSH含量的影响1）

2.3 AD－67对玉米根中ALS酶活性的影响

单独使用AD－67浸种时，能提高玉米根中ALS活性（表4）。单嘧磺隆浓度为0.025、0.035mg／kg和0.050mg／kg时，AD－67各浓度处理，玉米根中ALS的活性均有一定程度提高；在单嘧磺隆同一浓度时，安全剂不同处理间的ALS活性差异达到极显著水平。其中AD－67浓度为1mg／kg时，玉米根中ALS活性最高，与无AD－67浸种的玉米根中ALS相比，活 性 分 别 增 加 了 26.66%、40.00% 和33.33%。上述结果说明：在活体条件下单嘧磺隆对玉米幼苗ALS有抑制作用，而保护剂AD－67明显诱导了玉米幼苗中ALS的活性，提高了玉米幼苗中ALS的含量。

表4 AD－67对玉米根中ALS活性的影响1）

3 结论与讨论

GSH是生物细胞中普遍存在的一种具有特殊功能的多肽，在生物的许多代谢生理过程中起到重要的生理作用。在高等植物的代谢生理过程中发现，植物在抵御不良环境及提高抗逆作用中，GSH起着非常重要的作用。研究表明：安全剂可以刺激玉米和其他植物中的GSH水平，达到解毒的目的［14－15］。单嘧磺隆通过对ALS酶的抑制而阻断支链氨基酸的生物合成，进而快速抑制植物细胞的分裂与伸长，达到化学除草的目的。范志金等研究表明，单嘧磺隆对不同玉米品种ALS的活性影响存在差异，高浓度则具有抑制作用，活体ALS活力差异与玉米品种的耐药力无相关性［6］。路凯等研究表明NA能间接激活ALS活性，从而减轻胺苯磺隆对水稻的药害［16］。安全剂对于ALS抑制剂的解毒作用机理并不是一个简单的线性化作用过程，也不是由一种物质或一个原因引起的。参与这一过程的各种物质交织在一起，相互作用和牵制，形成一种复杂的网式过程，从而出现解毒差异—表征［17］。

本研究表明：单嘧磺隆对玉米幼苗的生长指标（根长、株高）和生理指标（GSH含量、ALS活性）都有抑制作用；随着单嘧磺隆浓度的增加，抑制作用加强，且对生理指标的抑制比对生长指标的程度大，即植株生长指标还没显示出被害症状时其体内某些生理指标已经发生显著变化。在安全剂AD－67浸种处理下，玉米的生长指标、GSH含量、ALS活性均有不同程度的提高；在同一单嘧磺隆浓度下，安全剂各浓度处理之间的解毒效果差异达到显著或极显著的水平，当AD－67浓度为1mg／kg时，对玉米的保护效果最好。试验显示：当AD－67与单嘧磺隆浓度为一定配比时，才能较好地起到保护作物免受除草剂药害的作用。这说明高浓度的安全剂对作物也是一种外源化合物，会刺激和影响作物的生长［18］。AD－67能够提高玉米体内GSH含量，并增加ALS活性，从而缓解了单嘧磺隆对玉米幼苗产生的药害，表明了这是减轻单嘧磺隆对玉米药害的重要途径之一，即AD－67的解毒和代谢过程与作物体内的GSH和ALS含量密切相关。

［1］罗伟，沈健英.磺酰脲类除草剂的研究进展［J］.世界农药，2008，30（增刊）：16－21.

［2］邓金保.磺酰脲类除草剂综述［J］.世界农药，2003，25（3）：24－32.

［3］刘金胜，胡钧.磺酰脲类除草剂与其抗药性的研究进展［J］.农药科学与管理，2007，25（1）：28－31.

［4］李正名，贾国峰，王玲秀，等.磺酰脲类化合物及其除草用途［P］.CN1038679C，1998：06－10.

［5］范志金，钱传范，陈俊鹏，等.单嘧磺隆对小麦的安全性及在麦田除草效果的研究［J］.中国农学通报，2003，19（3）：4－8.

［6］范志金，陈俊鹏，党宏斌，等.单嘧磺隆对靶标乙酰乳酸合成酶活性的影响［J］.现代农药，2003，2（2）：15－17.

［7］Hatzios K K.Metabolism－based herbicide resistance：regulationby safeners［J］.Weed Science，2004，52（3）：454－467.

［8］叶非，徐伟钧.除草剂安全剂的生理生化作用机制研究进展［J］.植物保护学报，2008，35（4）：367－372.

［9］Ekler Z，Dutka F，Stephenson G R.Safener effects on acetochlor toxicity，uptake，metabolisMand glutathione S－transferase activity in maize［J］.Weed Research，1993，33（4）：311－318.

［10］Gronwald J W，Fuerst E P，Charlotte V，et al.Effect of herbicide antidotes on glutathione content and glutathion S－transferase activity of sorghuMshoot［J］.Pesticide Biochemistry and Physiology，1987，29（1）：66－76.

［11］Ray T B.Site of action of chlorsulfuron［J］.Plant Physiology，1984，75（3）：827－831.

［12］叶非，曲虹云.安全剂R－28725保护玉米免受绿磺隆药害的机理［J］.植物保护学报，2003，30（2），187－192.

［13］Hirase K，MolinW T.Effect of flurazole and other safeners for chloroacetanilide herbicides on cysteine synthase in sorghuMroots［J］.Pesticide Biochemistry and Physiology，2001，71（2）：116－123.

［14］Matola T，Jablonkai I.Safening efficacy of halogenated acetals，ketals and amides and relationship between the structure and effect on glutathione and glutathione s－transferases inmaize［J］.Crop Protection，2007，26（3）：278－284.

［15］叶非，曲虹云.安全剂R－28725保护玉米免受氯嘧磺隆药害的机理研究［J］.农药学学报，2002，4（2）：57－61.

［16］路凯，钱传范.萘二甲酸酐减轻胺苯磺隆对水稻药害的作用机制［J］.植物保护学报，2000，27（3）：268－272.

［17］Scarponi L，Quagliarini E，Del Buono D.Induction of wheat and maize glutathione S－transferase by some herbicide safeners and their effect on enzyme activity against butachlor and terbuthylazine［J］.Pest Management Science，2006，62（10）：927－932.

［18］Nelson E A，Penner D.Reduction of isoxaflutole injury to corn（Zeamays）with herbicide safeners and water－repellent adjuvants［J］.Weed Technology，2006，20（4）：999－1003.