丹参饮对2型糖尿病性心肌病大鼠心肌的保护作用*

倪 青，王 阶△，赵安斌，于 斌，王 敏，黄春荣，李恩庆

(1.中国中医科学院广安门医院，北京 100053;2.暨南大学医学院，广东广州 510632)

糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病患者心肌细胞原发性损伤引起广泛的结构异常，最终引起左心室肥厚、舒张期和(或)收缩期功能障碍的一种疾病状态，是心肌对糖尿病的急性反应而导致的慢性病理改变。临床研究多中心1278例糖尿病合并冠心病住院病人在院治疗情况发现，丹参饮使用频率很高，开展本研究旨在验证丹参饮对治疗糖尿病心肌病的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

Trizol购自invitrogen生物技术科技公司，RNA逆转录试剂盒购自上海贝博生物技术公司，实时荧光定量PCR试剂盒购自genecopoeia生物技术公司，TSP-1、TGF-β1、tribble-3 和 chymase 单克隆抗体购自美国 santa cruze生物技术公司，A-TGFβ1和 LTGF-β1多克隆抗体购自武汉博士德生物技术公司，ABC检测试剂盒购自美国vectro生物技术公司，BCA蛋白定量试剂盒购自上海贝博生物试剂公司，链尿佐菌素购自Sigma生物技术公司。丹参饮(丹参30g，檀香6g，砂仁6g)购自暨南大学附属第一医院中医科，以上药物丹参和檀香以10倍量水，煎煮1.5h后入砂仁10min，滤出药液后以6倍量水煎煮1h，合并2次药液，过滤并最后浓缩至0.6g/ml。

1.2 动物与造模方法

雄性SD大鼠42只，体重200g±20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。随机分为3组:正常组(n=12)只，对照组(n=15)和丹参饮组(n=15)。正常组喂以标准大鼠饲料，对照组及丹参饮组喂以高脂高热量饲料。4周后给予对照组及丹参饮组大鼠1次性腹腔注射链脲佐菌素50mg/kg，正常组大鼠给予同等剂量柠檬酸钠缓冲液腹腔注射;各组以原饲料继续喂养1周后，测定血糖，对照组及丹参饮组连续2次血糖≥16.7 mmol/L且有多饮、多食、多尿的大鼠纳入实验，共有38只大鼠纳入实验(正常组12只，对照组和丹参饮组各13只)。各组大鼠继续以原饲料喂养9周，同时丹参饮组每天予以丹参饮7.5ml/kg灌胃，模型组予以等量蒸馏水灌胃。分别在实验第8周、11周、14周禁食12h后杀死各组大鼠4只，心房取血，离心保留血清－20℃保存以备检测血脂、血糖、甘油三酯。采血完毕迅速处死大鼠取出心脏，冰盐水冲洗，剪除包膜、血管，称重并计算心脏重量指数，垂直于心脏左室长轴对称中点上下切取部分心肌，分别放入10%中性甲醛及2.5%戊二醛中固定，其余部分组织放入－80℃冰箱中保存。共有34只大鼠完成实验(模型组死亡1只，丹参饮组死亡1只，死亡原因可能为糖尿病并发症或感染)。

1.3 心电图观察心肌损伤程度

大鼠给予1%戊巴比妥纳2ml/kg腹腔注射后做心电图。

1.4 检测血糖甘油三酯总胆固醇的变化

心房取血5ml，离心保留血清－20℃保存以备检测血脂、血糖、甘油三酯。

1.5 HE染色

10%中性甲醛固定心肌组织标本，石蜡切片，行常规HE染色，光镜下观察心肌病理损害并拍照，结合超微结构的改变来评价心肌的病变。

1.6 透射电镜观察

在左心室中部留取小块组织，以2.5%戊二醛固定10min后细切(1.0×1.0mm)，再固定12h，1%锇酸固定1h，乙醇、丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋，超薄切片机制备超薄切片，电子染色，在荷兰PHILIPSTECNAI-10型透射电子显微镜观察心肌超微结构并摄片。

1.7 Masson染色

常规石蜡切片脱蜡后，行Masson染色，光镜下观察心肌细胞呈红色或黄色，胶原纤维呈蓝绿色，HMIAS彩色医学图文分析系统定量分析切片每个视野中CVF(CVF=同一图像中胶原面积/所测视野面积)，排除富含胶原的血管和疤痕区域。每个切片选取5个视野，最后取其均数。

1.8 Tunel细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡

常规石蜡切片脱蜡后，按试剂盒说明依次滴加试剂，荧光显微镜下观察，激发波长 450nm～500nm，发射波长515nm～565nm。每张玻片选取荧光表达最强的3～5个视野观察并由计算机自带扫描分析软件测定荧光强度与面积。指标的荧光值=平均荧光强度×平均荧光面积。

1.9 实时荧光定量PCR

RNA提取与cDNA的合成:采用Trizol按试剂盒说明提取RNA，经紫外分光光度计检测RNA纯度和浓度，经电泳法检测其完整性。按逆转录试剂盒说明进行逆转录。取2μl逆转录产物进行Reamtime PCR检测。

表1 引物序列(5′-3′)

引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

反应体系:2 ×AllinoneTM Q-PCR MIX 10μl，ddH2O 1μl，Forward Primer(4μM)2μl，Reverse Primer(4μM)2μl，Template cDNA 5μl。Total:20μl。

反应条件:预变性:95℃ 1min;变性:95℃ 15s;退火:60℃ 30s;延伸:72℃ 30s，共40个循环。

1.10 免疫组化染色

载玻片采用多聚赖氨酸行防脱片剂处理，常规石蜡切片脱蜡，0.3%H2O2封闭。置0.01 mol/L pH 6.0柠檬酸盐缓冲液中行微波修复抗原(中档火8min～10min，自然冷却到室温，反复3次)。山羊血清封闭，依次加入Ⅰ抗(1∶100小鼠抗 tsp-1，Santa Cruz)、生物素标记的山羊抗小鼠IgG和辣根过氧化物酶标记的卵蛋白-生物素，37℃孵育30 min。以DAB显色，脱水、透明、封片。阴性对照用PBS代替Ⅰ抗。用Leica Qwin Plus分析系统对染色后的图片进行灰度分析，对每张切片随机选取5个不重复的阳性反应视野照像，计算其平均灰度值。

1.11 Western blotting检测蛋白表达情况

于超净工作台上，剪取约100mg组织，加入细胞裂解液400μl，于冰上研磨，转入1.5ml离心管中，于冰上裂解30min后，4℃ 12000r/10min，取上清液到1.5ml离心管中，此即为蛋白样品，－80℃冰箱中保存。取上述蛋白样品40μl，BCA试剂盒蛋白定量，绘制标准曲线。以上蛋白样品(取20μg)经10%聚丙烯凝胶电泳分离后进行转膜(湿转)，恒流(GAPDH:240MA，50min;tsp-1:240MA，140min)将蛋白转移到PVDF膜(孔径0.45μm)上。然后在封闭缓冲液(5%脱脂牛奶或BSA)中封闭1h，将膜放入封闭缓冲液稀释的Ⅰ抗(稀释比例:GAPDH:1∶100 稀释，tsp-1:1∶200 稀释;A-TGF-β1:1∶100;LTGF-β1:1∶100)中进行免疫反应，室温下持续摇动孵育2h，然后4℃过夜。1×PBST洗涤4次，每次5min。将膜用PBST缓冲液稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的Ⅱ抗(1∶6000稀释)，室温孵育50min，1×PBST洗涤4次，每次5min。于暗室中滴加新鲜配制的ECL显色液0.6ml(A、B液等体积混匀)，膜孵育1 min，封入保鲜膜中，压片，显影于感光胶片上。以上步骤独立重复3次。用Bandleader 3.0软件对条带进行灰度扫描，按下述公式分别计算3次实验中样品蛋白的相对含量:蛋白相对含量(该蛋白条带的灰度值－背景的灰度值)/(内参条带的灰度值－背景的灰度值)，以此比值计算均数与标准差。

1.12 统计学处理

所有数据用SPSS 13.0统计软件包进行分析。计量资料以s表示，组间参数的比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 大鼠一般生存状况及生化指标变化

模型组和丹参饮组空腹血糖在不同时间点逐渐降低，但是没有统计学意义(P>0.05);模型组和丹参饮组大鼠血清甘油三酯和总胆固醇水平逐渐增加，各组不同时点纵向比较差异显著(模型组和丹参饮组的甘油三酯的F值分别为F=25.429和F=7.198，P<0.01;模型组和丹参饮组总胆固醇的F值分别为F=9.065和F=10.952，P<0.01);正常组不同时点纵向比较，大鼠血清甘油三酯和总胆固醇水平无显著差异(P>0.05)，与相同时间点的正常组大鼠比较，模型对照组和丹参饮组大鼠血清甘油三酯和总胆固醇水平明显升高，丹参饮组大鼠血清甘油三酯和总胆固醇较模型对照组明显减低，各组之间两两比较，差异显著(P<0.01);与相同时间点的正常组大鼠比较，模型组和丹参饮组大鼠空腹血糖明显升高，与相同时间点的模型组相比，丹参饮组大鼠空腹血糖水平明显降低，各组之间两两比较，差异显著(P<0.05)。

2.2 心电图观察心肌损伤情况

大鼠心电图显示，ST段抬高明显，提示心肌已损伤。

2.3 病理观察

HE染色可见，正常大鼠心肌细胞排列整齐、致密，结构清晰，细胞外间质较少，可见少量成纤维细胞(图1A)。DM大鼠心肌细胞排列紊乱，心肌细胞肥大、扭曲，细胞间隙增大，间质和血管周围细胞外基质增多，成纤维细胞增多，并有炎症细胞浸润(图1B)。丹参饮组介于两者之间，与模型对照组相比，细胞间隙减小，间质和血管周围细胞外基质减少(图1C)。

图1 各组大鼠心肌组织HE染色观察(200×)

2.4 电镜观察心肌亚细胞结构

正常大鼠心肌细胞排列整齐，结构清晰，细胞间质胶原含量很少，毛细血管内皮细胞及基底膜结构正常(图2A)。DM大鼠心肌细胞肌丝纤维稀疏、扭曲、断裂，线粒体肿胀，数量减少，排列紊乱，空泡变性，部分嵴断裂，糖原减少，间质胶原增生，毛细血管内皮细胞肿胀，毛细血管基底膜增厚(图2B)。丹参饮组较DM组明显减轻，间质胶原沉积较少，毛细血管基底膜增厚减轻，介于正常组和对照组之间(图2C)。

图2 各组大鼠心肌组织电镜观察(15000×)

2.5 Masson染色观察胶原表达情况

采用Image Pro Plus图像分析系统进行心肌组织胶原相对含量测定，实验结果表明，与正常组相比，糖尿病心肌病变大鼠心肌组织胶原相对含量明显增加(P<0.01)，提示该模型大鼠存在胶原纤维增生病变;与模型组相比，丹参饮组能减少心肌组织胶原相对含量(P<0.05)，提示丹参饮可以明显抑制胶原纤维增生。

图3 各组大鼠心肌组织masson染色(100×)

表1 各组大鼠左室组织Masson染色胶原纤维定量分析结果(s)

表1 各组大鼠左室组织Masson染色胶原纤维定量分析结果(s)

注:与正常组比较:△P<0.01;与模型对照组比较:*P<0.05

组 别n 间质胶原纤维体积正常对照组12 10.38±2.76模型对照组 11 18.42±3.55△丹 参 饮 组 12 15.66±3.12*

2.6 Tunel细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡

正常组大鼠的心肌组织仅可见少数细胞凋亡(图4A)，与正常组相比，模型组凋亡细胞数目明显增多(图4B)，与模型组相比，丹参饮组凋亡细胞显著减少(图4C)。

图4 各组大鼠心肌组织细胞凋亡水平(200×)

2.7 实时荧光定量PCR检测结果

与正常组相比，模型组 TSP-1和 TRB-3的mRNA表达水平均明显升高(P<0.01)。与模型组相比，丹参饮组TSP-1和TRB-3的mRNA表达水平显著降低(P<0.01)。

表2 各组大鼠心肌TSP-1和TRB-3的mRNA表达水平(s)

表2 各组大鼠心肌TSP-1和TRB-3的mRNA表达水平(s)

注:△P<0.01，*P<0.05

组 别n TSP-1 TRB-3正常对照组12 0.0096±0.0042 0.0073±0.0025模型对照组 11 0.0152±0.0051* 0.0137±0.0031△丹 参 饮 组 12 0.0126±0.0049* 0.0096±0.0014△

2.8 免疫组织化学染色

TSP-1染色阳性信号为棕色颗粒，定位于心肌细胞胞浆内。正常组心肌细胞胞浆内可见分布均匀、稀疏的浅棕色颗粒(图5A)，模型组心肌细胞内可见浓密的深棕色颗粒(图5B)，丹参饮组心肌细胞内棕褐色颗粒可见明显减少(图5C)。与正常组相比，模型组心肌TSP-1蛋白表达量明显升高;与模型组相比，丹参饮组TSP-1表达量明显降低，3个组两两相比差异显著，差异有统计学意义(P<0.01)。

图5 各组大鼠心肌TSP-1免疫组织化学染色(200×)

TGF-β1染色阳性信号为棕色颗粒，定位于心肌细胞胞浆内。正常组心肌细胞胞浆内可见散在、稀疏的浅棕色颗粒(图6A)，模型组心肌细胞内可见浓密的深棕色颗粒(图6B)。丹参饮组心肌细胞内棕色颗粒可见明显减少(图6C)。与正常组相比，模型组心肌TGF-β1蛋白表达量明显升高;与模型组相比，丹参饮组TSP-1表达量明显降低，3个组两两相比差异显著，差异有统计学意义(P<0.01)。

图6 各组大鼠心肌组织TGF-β1免疫组织化学染色(200×)

Chymase染色阳性信号为棕色颗粒，定位于心肌细胞间隙及肥大细胞胞浆，正常组心肌组织内可见散在稀疏的浅棕色颗粒(图7A)，DCM组心肌组织内可见较多的深棕色颗粒(图7B)。丹参饮组心肌组织内棕色颗粒可见明显减少(图7C)。与正常组相比，模型组心肌Chymase蛋白表达量明显升高;与模型组相比，丹参饮组Chymase表达量明显降低，3个组两两相比差异显著，差异有统计学意义(P<0.01)。

图7 各组大鼠心肌组织Chymse蛋白免疫组织化学染色(200×)

TRB-3染色阳性信号为棕色颗粒，定位于心肌细胞胞浆内，正常对照组心肌细胞胞浆内可见散在稀疏的浅棕色颗粒(图8A)，模型组心肌细胞内可见浓密的深棕色颗粒(图8B)。丹参饮组心肌细胞内棕色颗粒可见明显减少(图8C)。与正常组相比，模型组心肌TRB-3蛋白表达量明显升高;与模型组相比，丹参饮组TSP-1表达量明显降低，3个组两两相比差异显著，差异有统计学意义(P<0.01)。

图8 各组大鼠心肌组织TRB-3蛋白免疫组织化学染色(200×)

2.9 Western blot检测蛋白表达情况

心肌组织中 TGF-β1是以活性的 A-TGF-β1和非活性的L-TGF-β1形式存在的，与正常组相比，心肌组织中 TSP-1、A-TGF-β1、L-TGF-β1 3 种蛋白的表达水平均显著升高(P<0.01)。与模型组相比，丹参饮组的 TSP-1、A-TGF-β1、L-TGF-β1 3 种蛋白的表达水平均显著降低(P<0.05～0.01)。

表3 各组大鼠心肌TSP-1、A-TGF-β1和L-TGF-β1蛋白的表达水平(s)

表3 各组大鼠心肌TSP-1、A-TGF-β1和L-TGF-β1蛋白的表达水平(s)

注:△P<0.01，*P<0.05

组 别 n TSP-1 A-TGF-β1 L-TGF-β1 12 93.225±5.371 106.429±6.32 102.461±6.124模型对照组 11 129.772±6.548△ 139.812±7.26△ 144.633±7.377△丹 参 饮 组 12 118.392±6.226△ 124.385±6.65*126.377±6.924正常对照组*

3 讨论

本研究以高糖高脂高热量饮食诱导出胰岛素抵抗，加小剂量STZ注射建立的动物模型。HE染色病理切片显示，心肌细胞肥大、扭曲，细胞间隙增大，间质和血管周围细胞外基质增多。电镜观察显示，心肌细胞排列稀疏、断裂并有大量胶原纤维分布。结合心电图示心肌受损，提示本研究已成功地建立了糖尿病心肌病的动物模型。

丹参饮出自《时方歌括》，由丹参、檀香、砂仁3味药物组成，方中重用丹参活血祛瘀为君药;檀香、砂仁行气宽中而止痛为佐使，主要用于血瘀气滞、心胃诸痛证。在临床上主要应用于血瘀气滞型胸痹心痛。研究表明，丹参饮可以显著提高心肌缺血的保护能力，有效缓解缺血对心肌造成的损伤，使酶的外漏减少，从而起到保护心肌的作用[1]。现代药理研究证实，丹参饮可使冠状动脉扩张，增加冠脉血流量;对周围血管也有扩张作用，而致血压降低。当心功能不全时，可改善心肌收缩力，促进侧支循环及体内血流的再分配，降低冠心病患者的血浆黏度，加速红细胞电泳率，改善红细胞比容，进而改善微循环。本实验发现，正常组大鼠心肌细胞排列整齐、致密，细胞间隙较少，masson染色显示心肌细胞间仅有少量胶原纤维，电镜观察心肌细胞排列整齐，线粒体完整，低倍镜下(1250×)成纤维细胞数目较少(≤2个)，而且成纤维细胞周围胶原纤维少。与正常组相比，模型组大鼠心肌细胞排列紊乱，细胞间隙较多，masson染色显示心肌细胞间充满大量胶原纤维，电镜观察心肌细胞肌丝断裂崩解，线粒体肿胀、破裂，低倍镜下(1250×)成纤维细胞数目较多(≥5个)，而且成纤维细胞周围聚集大量胶原纤维。丹参饮组介于两者之间，与模型组相比，丹参饮组大鼠心肌细胞排列较为整齐，细胞间隙胶原纤维较少，电镜低倍镜下(1250×)成纤维细胞数目为2～4个，成纤维细胞周围有中等量的胶原纤维，提示丹参饮可以有效延缓糖尿病大鼠心肌病发生。

TSP-1对多种间质细胞的分化、增生具有很强的调控作用，其异常表达在多种类型纤维化疾病进程中起关键作用[2]。有研究表明，糖/TSP-1/TGF-β1信号传导途径在糖尿病心肌病心肌间质纤维化发生发展过程中起着重要的作用[3]。最近1项有关TRB3信号转导通路的研究结果表明，TRB3对MAPK信号转导通路的连锁反应具有广泛和特异的调控作用，TRB3与MAPKK结合而调控MAPK通路信号蛋白的活性[4]。大量研究证实，MAPK不仅是糖尿病慢性并发症发生发展过程的关键细胞因子[5]，也是心肌纤维化过程中重要的信号转导通路[6]。研究证实，糖尿病状态下，心肌局部升高的Ang II，通过多条途径引起心肌氧化应激、细胞凋亡、心肌间质胶原沉积以及心肌纤维化，在糖尿病心肌病变变的发生中扮演着重要角色[7]。Chymase除了通过生成Ang II引起心肌病变，还可能直接激活TGF-β从而诱导细胞增殖，促使心肌纤维化[7]。本实验结果表明，与正常组相比，模型对照组masson染色胶原纤维表达增多，电镜观察成纤维细胞周围胶原纤维表达增高，免疫组化结果表明，与正常组相比，模型组大鼠心肌细胞 TSP-1、TGF-β1、chymase、TRB-3表达量均明显增高，差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比，丹参饮组大鼠心肌细胞TSP-1、TGF-β1、chymase、TRB-3 有不同程度的降低，差异有统计学意义。结合masson染色及电镜结果，提示丹参饮可以有效缓解糖尿病心肌病的心肌纤维化进程，减轻糖尿病心肌病的纤维化程度。Western半定量结果显示，与正常组相比，模型对照组的TSP-1、A-TGF-β1、L-TGF-β1 表达量均明显升高。荧光定量PCR结果显示，与正常组相比，模型对照组的TSP-1、TRB-3 mRNA的表达量增高，说明模型组大鼠心肌组织中纤维化过程中的关键因子在基因和蛋白水平均表达明显增高。非活性的L-TGF-β1虽然不直接参与糖尿病心肌病的纤维化过程，但是表达水平仍然升高，这与其他研究结果一致，可能是由于TGF-β1基因表达增多，从而导致L-TGF-β1表达量也增高。与模型组相比，丹参饮组的TSP-1、ATGF-β1、L-TGF-β1 表达量均明显降低，提示丹参饮可以通过降低纤维化过程中的细胞因子TSP-1、ATGF-β1、L-TGF-β1，从而延缓心肌纤维的发生。

[1]李然，刘立萍.丹参饮对大鼠急性心肌缺血的保护作用[J].辽宁中医杂志，2008，35(12):1944-1945.

[2]Morishima Y，Nomura A，Uchida Y，et al.Triggering the induction of myofibroblast and fibrogenesis by airway epithelial shedding[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2001，24:1-11.

[3]钟鸣，张薇，苗雅，等.糖/血小板反应素-1/转化生长因子 β1信号传导途径在糖尿病心肌病发病中的作用[J].中华心血管病杂志，2006，34(3):217-220.

[4]Regulation of expression and signaling modulator function of mammalian tribbles is cell-type specific[J].Immunllogy Letters，2006，10:171-177.

[5]Ling Li，SAWAMURA Tatsuya，RENIER Geneviève.Glucose enhances human macrophage LOX-1 expression:Role for LOX-1 in glucose-induced macrophage foam cell formation[J].Cire Res，2004，94(7):892-90.

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